La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité
Summary
Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.
Abstract
La microglie, les cellules immunitaires résidents dans le cerveau, sont les premiers intervenants à l’inflammation ou de lésions au système nerveux central. Recherches récentes ont révélé des microglies d’être dynamique, capable d’assumer des phénotypes pro-inflammatoires et anti-inflammatoires. Les M1 (pro-inflammatoires) et M2 phénotypes (pro-réparatrice) jouer un rôle important dans les conditions thérapeutiques tels que les lésions cérébrales périnatales et différant de la pièce fonctionne en réponse à certains stimuli de l’environnement. La modulation de l’activation des microglies a été notée pour conférer la neuroprotection, suggérant ainsi la microglie peut avoir potentiel thérapeutique dans les traumatismes crâniens. Cependant, plus de recherches sont nécessaires pour mieux comprendre le rôle des microglies dans la maladie, et qui facilite le présent protocole. Le protocole décrit ci-dessous associe un procédé de centrifugation en gradient de densité afin de réduire les débris cellulaires, avec séparation magnétique, produisant un échantillon très pur des microglies primaire qui peut être utilisé pour l’expérimentation in vitro , sans le besoin de 2-3 semaines de culture. En outre, les étapes de la caractérisation d’obtenir des données fonctionnelles robustes sur la microglie, aidant les études afin d’améliorer notre compréhension de la polarisation et l’amorçage de ces cellules, qui a des implications fortes dans le domaine de la médecine régénérative.
Introduction
Dommages acquis durant la période périnatale de l’inflammation, hypoxie-ischémie et hémorragie peuvent avoir un tableau des séquelles à long terme. La physiopathologie complexe de lésion cérébrale périnatale est théorisée à impliquer l’inflammation et l’ischémie avec qui a suivi la mort neuronale et axonale1. La réponse immunitaire innée joue un rôle important dans la cascade d’événements menant à dommage2.
La microglie, les cellules immunitaires résidents dans le système nerveux central (CNS), sont les premiers intervenants à3de la blessure. La microglie sont des types de cellules en plastique avec la capacité d’être protectrice ou toxique, dépendant de l’ environnement4. Ils sont impliqués dans la chimiotaxie, phagocytose, présentation de l’antigène et production de cytokines et de4,espèces réactives de l’oxygène5. La microglie sénescente constamment enquête sur l’environnement et sont activés par la présence d’une substance étrangère ou nocive4. Activation entraîne une réponse pro-inflammatoire, critique à la CNS protection4. Ces microglies de phénotype « pro-inflammatoires » M1 sont principalement liés à la présentation des antigènes et la mort des agents pathogènes4. Malgré le rôle crucial de la réponse inflammatoire dans la neuroprotection, inflammation incontrôlée ou prolongée peut être dangereux et causer des dommages neuronaux4. Toutefois, lorsqu’ils sont exposés à certains stimuli de l’environnement, la microglie peut exposer un phénotype anti-inflammatoires. Ces cellules microgliales les M2 pro-réparatrice ont un rôle essentiel dans la guérison des plaies et de réparer les6, libérant une gamme des cytokines et autres médiateurs solubles qu’atténuent l’inflammation, augmenter la phagocytose et promouvoir la réparation4, 7. le rôle des microglies sont divers et comprennent la conduite différenciation des oligodendrocytes lors de re-myélinisation8, protection des neurones au cours de l’épuisement d’oxygène et de glucose dans la course des modèles9 et promouvoir la croissance des neurites dans 10les modèles de la moelle épinière.
L’étude de ces cellules gliales représente un aspect important dans la compréhension et la manipulation de la réponse à la neuro-inflammation. Le protocole décrit permet pour complément d’enquête sur le potentiel thérapeutique de la modulation de la microglie dans neuroinflammatoire troubles.
La modulation de l’activation microgliale vers un rôle neuroprotecteur a été observée dans une gamme de conditions11,12,13. Ainsi, l’amélioration de notre compréhension actuelle et encore étudiant modulation d’activation microgliale est critique, nécessitant l’utilisation de différents modèles, y compris les deux in vitro et in vivo. Des études in vitro représentent un outil important en raison leur plus grande efficacité, coût et de capacité d’enquêter sur une population de cellules isolées.
Il y a une gamme de protocoles décrits dans la littérature pour l’isolement des cellules microgliales du cerveau murin, le défi de produire efficacement un échantillon de rendement élevé avec bonne viabilité et de grande pureté. Les méthodes couramment utilisées de l’isolement des microglies primaire sont par séparation magnétique et secouant prolongée des cultures mixtes de gliales. Par son expérience personnelle, il a été constaté qu’il y avait un degré élevé de débris cellulaires qui a empêché la colonne magnétique. Ainsi, le protocole suivant a été utilisé, qui comporte une étape de centrifugation en gradient de densité initiale suivie CD11b séparation magnétique. Le protocole décrit ci-dessous a été optimisé pour produire un échantillon très pur en quantité suffisante. Il est avantageux en raison de sa grande pureté et la courte période de temps — on peut effectuer des essais en 2 jours sans avoir à la culture pendant 2-3 semaines. Ce protocole peut être potentiellement adapté pour l’isolation des astrocytes murines primaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglies ont la capacité d’être pro – et anti-inflammatoires, altéré par des stimuli de l’environnement. Des études antérieures ont montré que la modulation de l’activation des microglies peut conférer la neuroprotection. Leur capacité à protéger les neurones et réparer les blessures nécessite plus de recherche pour approfondir la compréhension actuelle de ces cellules complexes. Ainsi, isolement des microglies primaire de haute pureté est une technique importante et utile. Il s’agit d’une mét…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O’Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
