Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung
Summary
Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.
Abstract
Mikroglia, die ansässigen Immunzellen im Gehirn, sind die first Responder, Entzündungen oder Verletzungen in das zentrale Nervensystem. Neuere Forschungen haben Mikroglia, dynamisch, fähig, Pro-inflammatorische und Anti-inflammatory Phänotypen gezeigt. (Pro-inflammatorischen) M1 und M2 (Pro-reparative) Phänotypen spielen eine wichtige Rolle in schwere Erkrankungen wie perinatale Hirnschädigung und Ausstellung unterschiedliche in Reaktion auf bestimmte Reize aus der Umwelt Funktionen. Die Modulation der Mikroglia-Aktivierung wurde festgestellt, Neuroprotektion hindeutet, Mikroglia therapeutisches Potenzial im Hirn-Trauma haben zu verleihen. Jedoch mehr Forschung ist erforderlich, um die Rolle der Mikroglia bei der Krankheit besser zu verstehen, und dieses Protokoll ermöglicht. Das Protokoll beschriebenen verbindet einen Dichte Steigung Zentrifugierung Prozess zur Reduzierung Zelltrümmer, magnetische Trennung, Herstellung von hochreinen Probe von primären Mikroglia-Zellen, die für in-vitro- Experimente, ohne verwendet werden kann die für 2-3 Wochen Kultivierung benötigen. Darüber hinaus ergeben die Charakterisierung Schritte robuste Funktionsdaten über Mikroglia, Studien, unser Verständnis von der Polarisation besser helfen und Grundieren dieser Zellen, die starke Auswirkungen auf dem Gebiet der regenerativen Medizin hat.
Introduction
Schäden, die während der Perinatalperiode von Entzündungen, hypoxische Ischämie und Blutungen kann ein Array von langfristig Folgeerscheinungen haben. Die komplexen Pathophysiologie der perinatalen Hirnschädigung ist die Theorie, Entzündungen und Ischämie mit daraus resultierenden neuronalen und axonalen Tod1einzubeziehen. Die angeborene Immunantwort spielt eine wichtige Rolle in der Kaskade von Ereignissen führen zu Verletzungen2.
Mikroglia, die ansässigen Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS), sind die first Responder auf Verletzungen3. Mikroglia sind Kunststoff Zelltypen mit einer Kapazität von Schutz- oder giftig, abhängig von der Umgebung4sein. Sie engagieren sich in der Produktion von Zytokinen und reaktive Sauerstoff Spezies4,5, Chemotaxis, Phagozytose und Antigenpräsentation. Alternde Mikroglia ständig Umfrage Umwelt und sind durch die Anwesenheit eines fremden oder schädliche Substanz4aktiviert. Aktivierung führt zu einer Pro-inflammatorischen Reaktion, kritische CNS Schutz4. Diese M1 “Pro-inflammatorischen” Phänotyp Mikroglia sind in erster Linie Antigenpräsentation und Tod von Krankheitserregern4beteiligt. Trotz der wichtigen Rolle der Entzündungsreaktion in Neuroprotektion kann unkontrollierte oder längerer Entzündung schädlich und führen zu einer neuronalen Schaden4sein. Jedoch kann bestimmte Reize aus der Umwelt ausgesetzt, Mikroglia eine entzündungshemmende Phänotyp aufweisen. Diese Pro-reparative M2 Mikroglia haben eine entscheidende Rolle bei der Wundheilung und reparieren6, veröffentlicht eine Reihe von Zytokinen und anderen löslichen Mediatoren, dass Downregulate Entzündung, Phagozytose zu erhöhen und fördern Reparatur4, 7. die Rolle der Mikroglia sind vielfältig und umfassen treibende Oligodendrozyt Differenzierung während Re-Myelinisierung8, Neuronen während Sauerstoff und Glukose Erschöpfung in Takt Modelle9 Schutz und Förderung der Neurit Auswuchs in Verletzung des Rückenmarks Modelle10.
Die Studie von diese Gliazellen ist einen wichtigen Aspekt beim Verständnis und bei die Reaktion auf Neuroinflammation zu manipulieren. Das beschriebene Protokoll kann zur weiteren Untersuchung in das therapeutische Potenzial der Mikroglia Modulation in schwere Erkrankungen.
Die Modulation der Mikroglia-Aktivierung auf eine neuroprotektive Rolle ist in einer Reihe von Bedingungen11,12,13beobachtet worden. Verbesserung der aktuellen Verständnis und weiter studieren Modulation der Mikroglia-Aktivierung ist kritisch, die den Einsatz von verschiedenen Modellen, darunter sowohl in Vitro und in Vivo. In-vitro- Studien sind ein wichtiges Instrument durch größere Effizienz, niedrigere Kosten und Fähigkeit zu eine isolierten Zellenbevölkerung zu untersuchen.
Es gibt eine Reihe von Protokollen beschrieben in der Literatur für die Isolierung von Microglia von murinen Gehirne, die Herausforderung, eine high-Yield-Probe mit guter Wirtschaftlichkeit und hoher Reinheit effizient zu produzieren. Häufig verwendete Methoden der Isolierung des primären Mikroglia sind durch magnetische Trennung und längeren schütteln von Gliazellen Mischkulturen. Durch persönliche Erfahrung wurde festgestellt, dass gab es ein hohes Maß an Zelltrümmer die magnetische Spalte behindert. So wurde das folgende Protokoll verwendet, die enthält eine Anfangsdichte gradient Zentrifugationsschritt gefolgt von CD11b magnetische Trennung. Die nachfolgend beschriebene Protokoll wurde optimiert, um eine hochreine Probe in ausreichender Menge zu produzieren. Aufgrund seiner hohen Reinheit und die kurze Zeit vorteilhaft ist — man kann Assays innerhalb von 2 Tagen auszuführen, ohne Kultur für ca. 2-3 Wochen. Dieses Protokoll kann potenziell für die Isolierung von primären murinen Astrozyten angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroglia haben die Möglichkeit, pro- und Anti-inflammatory, werden durch Reize der Umgebung verändert. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Modulation der Mikroglia-Aktivierung Neuroprotektion verleihen kann. Ihre Fähigkeit zur Gewährung von Schutz für Neuronen und Verletzungen zu reparieren erfordert mehr Forschung, um das aktuelle Verständnis dieser komplexen Zellen zu fördern. Somit ist die Isolierung von hoher Reinheit primären Mikroglia eine wichtige und nützliche Technik. Dies ist eine relativ schnell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
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