Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità
Summary
Un protocollo per l’isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.
Abstract
Microglia, le cellule immunitarie residente nel cervello, sono i primi soccorritori per infiammazione o lesioni nel sistema nervoso centrale. La ricerca recente ha rivelato microglia di essere dinamico, capace di assumere fenotipi sia pro-infiammatorie e anti-infiammatori. Sia M1 (pro-infiammatori) e M2 (pro-riparativa) fenotipi giocare un ruolo importante in condizioni neuroinfiammatorie come lesione cerebrale perinatale e mostre differenti funzioni in risposta a determinati stimoli ambientali. La modulazione dell’attivazione microglial è stata notata per conferire neuroprotezione suggerendo le microglia possono avere potenziale terapeutico nella ferita di cervello. Tuttavia, più ricerca è necessaria per comprendere meglio il ruolo della microglia nella malattia, e questo protocollo che facilita. Il protocollo descritto sotto combina un processo di centrifugazione su gradiente di densità per ridurre i detriti cellulari, con separazione magnetica, produrre un campione altamente puro di cellule microgliali primario che può essere utilizzato per la sperimentazione in vitro , senza la bisogno per 2-3 settimane di coltura. Inoltre, le operazioni di caratterizzazione resa solida funzionale dei dati sulla microglia, aiutando gli studi per migliorare la nostra comprensione della polarizzazione e l’innesco di queste cellule, che ha forti implicazioni nel campo della medicina rigenerativa.
Introduction
Danni acquisiti durante il periodo perinatale da infiammazione, ipossia-ischemia ed emorragia possono avere una serie di conseguenze a lungo termine. La patofisiologia complessa di lesione cerebrale perinatale è teorizzata per coinvolgere l’infiammazione e ischemia con conseguente morte neuronale ed assonale1. La risposta immunitaria innata svolge un ruolo importante nella cascata di eventi che portano a lesioni2.
Microglia, le cellule immunitarie residente all’interno del sistema nervoso centrale (CNS), sono i primi soccorritori a lesioni3. Le microglia sono tipi di cella in plastica con la capacità di essere sia protettiva o tossiche, dipende l’ ambiente4. Essi sono coinvolti nella chemiotassi, fagocitosi, presentazione dell’antigene e produzione di citochine e di specie reattive dell’ossigeno4,5. Senescenti microglia costantemente l’ambiente di indagine e vengono attivati dalla presenza di una sostanza straniera o nocivo4. Attivazione conduce ad una risposta pro-infiammatoria, critica in CNS protezione4. Queste microglia “pro-infiammatorie” fenotipo M1 sono principalmente coinvolti nella presentazione dell’antigene e la morte di agenti patogeni4. Nonostante il ruolo cruciale della risposta infiammatoria nella neuroprotezione, infiammazione incontrollata o prolungata può essere nocivo e portare a danno di un neurone4. Tuttavia, quando esposti a determinati stimoli ambientali, le microglia possono esibire un fenotipo anti-infiammatorio. Queste microglia M2 pro-riparativi hanno un ruolo critico nella guarigione delle ferite e la riparazione6, rilasciando una serie di citochine e altri mediatori solubili che downregulate l’infiammazione, aumentare la fagocitosi e promuovere la ripristino4, 7. i ruoli di microglia sono diversi e comprendono guida differenziazione del oligodendrocyte durante re-mielinizzazione8, proteggere i neuroni durante lo svuotamento di ossigeno e glucosio nel tratto modelli9 e promuovere neuriti in ferita del midollo spinale modelli10.
Lo studio di queste cellule gliale rappresenta un aspetto importante nel comprendere e manipolare la risposta al neuroinflammation. Il protocollo descritto consente ulteriore indagine il potenziale terapeutico della modulazione di microglia in malattie neuroinfiammatorie.
La modulazione dell’attivazione microglial verso un ruolo neuroprotettivo è stata osservata in una gamma di circostanze11,12,13. Così, migliorando la comprensione corrente e ulteriormente studiando la modulazione dell’attivazione microglial è critica, che richiedono l’uso di vari modelli tra cui sia in vitro che in vivo. Studi in vitro rappresentano uno strumento importante a causa della loro maggiore efficienza, basso costo e capacità di indagare su una popolazione di cellule isolate.
Ci sono una serie di protocolli descritti nella letteratura per l’isolamento di microglia dal cervello murino, la sfida di produrre in modo efficiente un campione ad alto rendimento con elevata purezza e buona redditività. Metodi comunemente usati di isolamento della microglia primaria sono separazione magnetica e scuotendo prolungata delle colture miste gliale. Attraverso l’esperienza personale, è stato trovato che c’era un alto grado di detriti cellulari che hanno ostruito la colonna magnetica. Così, è stato utilizzato il seguente protocollo, che incorpora un passo di centrifugazione su gradiente di densità iniziale seguito da separazione magnetica CD11b. Il protocollo descritto di seguito è stato ottimizzato per produrre un campione altamente puro in quantità sufficiente. È vantaggioso grazie alla sua elevata purezza e il breve periodo di tempo — uno può eseguire le analisi entro 2 giorni senza dover fare cultura per 2-3 settimane. Questo protocollo potenzialmente può essere adattato per l’isolamento di astrociti di murini.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia hanno la capacità di essere sia pro – e anti-infiammatori, alterato da stimoli di ambiente. Studi precedenti hanno dimostrato che la modulazione dell’attivazione di microglia può conferire neuroprotezione. Loro capacità di fornire protezione ai neuroni e riparare lesioni richiede ulteriori ricerche per favorire la comprensione corrente di queste cellule complesse. Così, l’isolamento di elevata purezza primaria microglia è una tecnica importante ed utile. Si tratta di un metodo relativamente rapido per otte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O’Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
