Protocolo de diferenciação cerebelar 3D simplificada com modificação 2D opcional

1. preparações Nota: Para todas as etapas consulte Tabela de materiais para itens específicos. Preparar 500 mL definido hPSC meio de cultura para cultura hPSCNota: Utilize o meio de passos 2.1-2.6. Descongelar o hPSC médio suplemento durante a noite (o/n) a 4 ° C. Retire a 12,5 mL de meio base hPSC do frasco médio e, em seguida, adicionar 10 mL de suplemento e 2,5 mL (fazendo 100 U/L) penicilina/estreptomicina (caneta/Strep) no frasco. Armazenar a 4 ° C e usar dentro de 2 semanas.Nota: O hPSC médio pode ser utilizado para congelar células em baixo, adicionando 10 µM ROCK inibidor (RI) e 10% DMSO. Prepare o suporte de manutenção neural de 1L (NMM) para cultura de diferenciaçãoNota: Use médio para passos 3.1-4.4. Mix de glutamina fortificada DMEM/F12 e meio base neural (proporção de 1:1) em 1 litro de um garrafa, então suplemento com suplemento de N2 (1x), (1x) B27 de suplemento, 5 µ g/mL insulina, 1,5 mM L-glutamina, 100 µM não aminoácidos essenciais (timina), 100 U/L caneta/Strep e 10 µM Beta-Mercaptoetanol. Armazenar o médio a 4 ° C e usar dentro de 3 semanas.Nota: Antes de adicionar suplementos misto meio basal, retire o volume apropriado para ajustar o volume necessário de adicionado componentes baseados em concentrações estoque. Preparar 500 mL de solução de trabalho de EDTA 0,5 mM para passagem hPSCsNota: Utilize o meio de passos 2.4 e 2.5. Sob uma capa de fluxo, transferi 49 mL de fosfato tamponado salino (PBS) de uma garrafa de 500 mL de PBS estéril para um tubo de 50 mL. Adicione 0,5 mL de EDTA 0,5 M e 0,9 g de NaCl para o tubo de 50 mL. Misture suavemente para dissolver. Filtro-esterilizar solução usando um filtro de 0,22 µm e transferência para o frasco 500 mL de PBS estéril. Armazenar em temperatura ambiente (RT). Preparar hPSC placas de cultura para cultura hPSCNota: Utilize placas de passos 2.1-2.6. Fazer 50 x solução de trabalho de revestimento aderente hPSC apropriado (ROSIN APAIVA paiva): descongelar um frasco de ROSIN APAIVA paiva o/n a 4 ° C. Dilua ROSIN APAIVA paiva na proporção de 1:1 com DMEM/F12 e transferência como 400 alíquotas µ l para tubos de 1,5 mL. Armazenar a solução de trabalho 50 x ROSIN APAIVA paiva a-80 ° C.Obs: (importante) ROSIN APAIVA paiva solidifica rapidamente na RT, portanto é necessário que todos os componentes (DMEM, tubos, etc.) são mantidos no gelo (ou a 4 ° C). Descongelar o tubo de 50 x solução de trabalho ROSIN APAIVA paiva a 4 ° C e, em seguida, diluir 50 x em DMEM/F12 frio. Adicione 750 µ l/poço de ROSIN APAIVA paiva diluído para um 6WP. Incubar a placa pelo menos 1 h a 37 ° C.Nota: Placas ROSIN APAIVA paiva podem ser armazenadas por 1 semana a 4 ° C, envolvendo o prato após o período de incubação de 1 h. Chapa quente a 37 ° C antes de usar. Preparar pratos antiadesivo (AA) para cultura de diferenciaçãoNota: Utilize placas de passos 3.1-4.1. Fazer 5 mg/mL poli (metacrilato de 2-hidroxietil) solução (poli-HEMA) em 95% etanol. Agite o/n a 37 ° C até obter uma solução límpida. Loja em RT.Nota: Filtragem através de um filtro de 0,22 µm pode remover poli-HEMA não dissolvido. Adicione poli-HEMA na placa de cultura, de modo que cobre o fundo de cada poço. Incubar a placa a 37 ° C durante 2 dias e inspecione a placa para garantir a evaporação completa do líquido/uniforme de revestimento de poços. Placas de AA podem ser empacotadas e armazenadas no RT Preparar as placas de poli-L-ornitina/laminina (PLO/LAM) para cultura de diferenciaçãoNota: Utilize placas de passos 4.2-4.4. Revestimento da superfície dos poços, usando 20 µ g/mL PLO dissolvido em PBS estéril. Incubar a placa o/n a 37 ° C. PLO de aspirar e lavar 3 vezes com PBS.Nota: Prato (opcional) Incubated com PLO pode ser empacotado e armazenado a 4 ° C, até que seja necessário. Revestir as áreas de superfície dos poços revestidos PLO, usar 10 µ g/mL LAM dissolvida em PBS estéril. Incubar durante pelo menos 2 h a 37 ° C ou o/n a 4 ° C. Remover leite e lavagem poços de 2-3x com PBS, em seguida, adicione imediatamente meio apropriado e/ou células.Nota: Solução (opcional) removido LAM pode ser armazenada a 4 ° C e re-usada até 2 vezes. (Importante) Não permitem superfícies revestidas LAM secar; para evitar isto imediatamente adicione o PBS ou meio apropriado.   2. Protocolo 1: Livre de alimentador hPSC cultura Nota: hESCs foram obtidos a partir de uma organização não-comercial (linha H01, consulte Tabela de materiais). Três linhas de controle de hiPSC (hvs51, 60 e 88) foram gerados pela reprogramação de fibroblastos de três pacientes humanos saudáveis (fibroblastos foram derivadas de doadores anônimos, não-identificáveis e, portanto, isentos de aprovação IRB)10, 17. Manter hPSCs em cultura livre de alimentador Depois de descongelar e chapeamento hPSCs em placas de ROSIN APAIVA paiva hPSC médio (consulte a etapa 2.2), manter hPSCs a 37 ° C com 5% de CO2. Atualizar hPSC médio diariamente (ver passo 2.3), exceto o dia após o descongelamento ou passagem e examinar as células sob o microscópio (objetivos: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1) para observar o crescimento taxa e identificar áreas potenciais de diferenciação (Figura 3 , painel superior esquerdo mostra exemplo de diferenciação). Passagem hPSCs cada 3-4 dias, ou quando a cultura atinge > confluência de 80%. Se a menos de 5% de células exposição diferenciação, uso normal hPSC passagem método (ver passo 2.4), caso contrário, use o método suave (consulte a etapa 2.5). Quando não for necessário na cultura, hPSCs pode ser congelado para armazenamento a longo prazo (ver passo 2.6). HPSCs de degelo hPSC médio Transferi o volume necessário de hPSC médio para tubos estéreis para o processo de descongelação (9 tubo criogênico/mL) e a placa de ROSIN APAIVA paiva preparada para receber células descongeladas. Completar o médio em ambos os tubos com 10 µM de RI. Recupere o criotubo de LN2 armazenamento e lugar diretamente em um banho de água (37 ° C). Quando apenas uma pequena restos de cristal de gelo, retire do banho e transferir o conteúdo do tubo criogênico do tubo para o processo de descongelamento (total de volume de 10 mL). Centrifugar o tubo a 290 x g durante 5 min à RT Usar uma pipeta sorológica para remover a ROSIN APAIVA paiva solução dos poços da placa ROSIN APAIVA paiva (consulte a etapa 1.4) destinado a receber as células e adicionar hPSC médio com 10 µM de RI.Nota: (importante) fazer não aspirado solução ROSIN APAIVA paiva com uma agulha de aspiração, ou ele pode solidificar e entupir as linhas para a bomba de vácuo. Remover o sobrenadante do tubo e ressuspender as células hPSC médio com 10 µM de RI. Distribua as células para a placa de destino na proporção de 1 tubo criogênico/poço de 6WP. Incubar a 37 ° C com 5% de CO2e não se refrescar médio para 1 dia.Nota: Arranque células em 5% O2 pode aumentar a sobrevivência da pilha. Atualizar o hPSC médio Aquecer o volume necessário de hPSC médio em um tubo estéril no RT ou num banho de água; sugere-se 2 mL/poço das 6WP.Nota: (Opcional): adicionando uma quantidade extra de hPSC médio, hPSCs pode ficar mais um dia sem atualizar; no entanto, não permita mais de uma vez por semana. Aspire o meio de poços contendo hPSCs e adicionar hPSC fresco médio. Cultura do hPSCs em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Passagem hPSCs médio/hPSC Transferi o volume necessário de hPSC médio para tubos estéreis, por processo de passagem e para a preparação da placa ROSIN APAIVA paiva receber células passadas. Completar o meio para a placa de destino com 10 µM de RI. Aqueça os tubos no RT ou num banho de água.Nota: Preparação e manipulação serão diferentes se usar um material de revestimento alternativo que um listado na Tabela de materiais. Usar uma pipeta sorológica para remover a ROSIN APAIVA paiva solução dos poços da placa ROSIN APAIVA paiva (consulte a etapa 1.4) destinado a receber as células e adicionar hPSC médio com 10 µM de RI.Nota: (importante) que não aspire a solução ROSIN APAIVA paiva com uma aspiração da agulha, que possa solidificar e entupir as linhas para a bomba de vácuo. Aspire o meio de poços com hPSCs para ser passadas, lavar as células duas vezes com 0,5 mM EDTA, em seguida, adicionar 0,5 mM EDTA e incubar durante 2-5 min a 37 ° C.Nota: 1 mL/poço de 6WP é um volume suficiente de EDTA para lavagem e incubação. Verifique os poços sob o microscópio (objetivos: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1). Se as células estão começando a se destacar, Aspire a solução de EDTA e células descarga livre usando hPSC médio.Nota: (importante) tome cuidado para não remover toda hPSC colônias quando aspirar EDTA (não espere até que todo colônias são desanexando). Não liberar células mais do que 5 vezes como isso pode prejudicar o hPSCs e afetam a pluripotência. Além disso, não deixe células perante hPSC médio com RI rubor células de poços, como eles podem re-aderir à placa. Com base na determinação empírica (geralmente relacionada a confluência, tamanho das colônias e a taxa de crescimento), transferir hPSCs aos poços da placa de destino usando uma divisão relação de 1:4-1:16 (ou seja, 1 poço da placa original de 4 poços do destino placa). Incubar a 37 ° C com 5% de CO2e não se refrescar médio para 1 dia.Nota: Divisão de proporções tão altas quanto 01:16-01:20 são possíveis de evitar aglomeração e melhorar a aparência das colônias. HPSCs de passagem usando o suave-método (G) Transferi o volume necessário de hPSC médio para tubos estéreis, para o processo de passaging e para a preparação da placa ROSIN APAIVA paiva receber células passadas. Completar o meio para a placa de destino com 10 µM de RI. Tubos quentes no RT ou em banho-maria a 37 ° C. Pipeta sorológica uso para remover ROSIN APAIVA paiva solução de poços da placa ROSIN APAIVA paiva (consulte a etapa 1.4) destinado a receber as células e adicionar hPSC médio com 10 µM de RI.Nota: (importante) fazer não aspirado ROSIN APAIVA paiva com uma agulha de aspiração, ou ele pode solidificar e entupir as linhas para a bomba de vácuo. Aspire o médio dos poços com hPSCs para ser passadas e lavar as células duas vezes usando 0.5 mM EDTA. Na segunda lavagem, espere 30 s antes de aspirar o EDTA, então adicione 1 mL de PBS e incube por 4-9 min a 37 ° C. Enquanto espera, prepare um tubo estéril com 4 mL de PBS.Nota: 1 mL/poço de 6WP é um volume suficiente de EDTA para lavar. Verifique os poços sob microscópio (objetivos: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1). Se as células estão começando a retirar, cuidadosamente, bata nos lados da placa para ajudar livre colônias. Quando > 50% das colônias são livres de flutuante, usar uma pipeta sorológica 5ml para transferir colônias em 1 mL de PBS para o tubo contendo 4 mL de PBS (não triture).Nota: (importante) desde que o objetivo é limpar o hPSC cultura, verificação para determinar se diferenciadas células permanecem anexado à placa. Além disso, não é necessário para a passagem de todas as colônias em um bem usando este processo, então colônias que permanecem anexadas podem ser deixadas para trás. Espere 5-10 min a RT para células resolver no tubo (não centrifugar). Aspire PBS do tubo, cuidando para não remover hPSCs resolvido. Cuidadosamente Ressuspender as células em meio de hPSC (não triture) e transferir as células para a placa de destino usando uma divisão relação de 1:4-1:16. Incubar a 37 ° C com 5% de CO2e não se refrescar médio para 1 dia. Congelar para baixo hPSCs Dependendo da confluência, use 1 bem de hPSCs, em 2-3 dias (máximos) em cultura, para encher frascos de criopreservação de 1-2 para armazenamento em LN2. No final da passagem (etapa 2.5), usar 500 µ l ou 1 mL de meio de hPSC transferir células de 1 bem de 6WP para 1 ou 2 frascos de criopreservação, respectivamente (500 µ l/frasco). A cada tubo, adicione 500 µ l de 2 x congelamento médio contendo hPSC médio, 20 µM RI e 20% DMSO.Nota: As células (opcional) podem ser transferidas diretamente em 1x congelamento médio em 1 mL/frasco. Coloque os tubos criogênicos em um recipiente criogênico (contendo isopropanol) previamente resfriados a 4 ° C e imediatamente em-80 ° C. No dia seguinte, transfira os tubos criogênicos para um tanque de2 LN para armazenamento a longo prazo. 3. protocolo 2: 3D “organoides” diferenciação Instalação de diferenciação com G-método modificado da passagem de hPSCs Transferi o volume necessário de NMM para o número de poços de destino para um tubo estéril. Suplemento com 4 ng/mL FGF2 e 10 µM RI. Aquecer o tubo médio no RT ou em banho-maria a 37 ° C.Nota: Dependendo da confluência dos poços de originação, hPSCs estão concentrados durante a distribuição para a placa de destino em um 2:1 ou 3:1 ratio (ou seja, 2 poços da placa original de 1 bem da placa de destino), com um volume final de 2,5 mL/poço de 6WP. Aspire o meio de poços que contém hPSCs para ser diferenciado e lavar as células duas vezes usando 0.5 mM EDTA. Na segunda lavagem, espere 30 s antes de aspirar o EDTA, então adicione 1 mL de PBS e incube por 4-9 min a 37 ° C. Enquanto espera, prepare um tubo estéril com 4 mL de PBS.Nota: 1 mL/poço de 6WP é um volume suficiente de EDTA para lavar. (Importante) É preferível usar hPSCs que eram não mais de 3 dias em cultura após a última passagem e pelo menos 1-2 passagens após o descongelamento. Verifique poços sob o microscópio (objetivos: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1). Se as células estão começando a desanexar, livre as células tocando suave nas laterais da placa. Transfira as células para um tubo contendo 4 mL de PBS com uma pipeta de 5 mL.Nota: (importante) leve rubor e trituração é permitido para quebrar acima colônias e recolher pilhas soltas, mas ignorar as células que permanecem aderidas à placa. Permitir que o tubo se sentar por 10 min em RT, para separação de gravidade. Opcionalmente, Centrifugar as células levemente (não superior a 200 g de x em RT, por 5 min) se necessário. Aspire a PBS do tubo, cuidando para não remover hPSCs resolvido, Ressuspender as células em NMM com 4 ng/mL FGF2 e 10 µM RI e depois distribuir a placa AA-revestido na proporção de 2:1 ou 3:1. Incubar a 37 ° C com 5% de CO2e não atualizar o médio durante 3 dias, a menos que exigido (ver passo 3.2.1).Nota: (Opcional) para a conveniência da transferência de células, adicione uma porção do meio de cultura aos poços da placa de destino antes da distribuição e ressuspender as células em um volume menor. Além disso, hPSCs pode ser manchado e contados definir a densidade exata de célula inicial. No entanto, o volume final da placa de destino deve ser 2,5 mL/poço das 6WP. Manter a cultura livre flutuação diferenciação a 37 ° C (5% CO2) Verifique as placas de todos os dias para que as alterações na cor média, acúmulo de células mortas, aglutinando e adesão ao bem fundo. Opcional: Independentemente do médio alterar agendamento, atualizar (incluindo os 3 primeiros dias do não refrescante) o meio se transformou amarelo e siga as instruções para alterar/atualizar médio (passo 3.3). Se a maioria das células aparece morta, siga as instruções para alterar/atualizar médio com separação de gravidade (passo 3.4).Nota: Formação de EBs e crescimento em agregados de células grandes são esperados, mas células e agregados de células podem aglutinar-se em grandes massas não devido ao crescimento individual/proliferação. Se isto for observado, trituração luz romper massas é admissível. Se células começam a aderir à superfície da placa de AA, os restantes flutuante conteúdo dos poços podem ser transferidos diretamente para novos poços ou transferidos durante o processo de alteração/atualização médio. Não tente transferir células que tenham aderido à placa. No dia 3, altere o meio para NMM com FGF2 de 4 ng/mL. Atualize o meio todos os dias. No dia 7, altere o meio para NMM com 1 µM 4 ng/mL FGF2, 100 ng/mL FGF8B e ácido retinoico (RA). Atualize o meio todos os dias.Nota: (importante) RA é sensível à luz. Protege as amostras de cultura RA da luz. No dia 14, mude o meio de NMM com 100 ng/mL FGF8B, FGF4 de 100 ng/mL e 20 ng/mL FGF2. Atualize o meio todos os dias. No dia 17, mude o meio de NMM com 100 ng/mL FGF8B. Atualize o meio todos os dias. No dia 21, mude o meio de NMM com 100 ng/mL cérebro derivada Neurotrophic Factor (BDNF) e 10 ng/mL gliais derivado Neurotrophic Factor (GDNF). Atualize o meio todos os dias. No dia 28, mude o meio de NMM com 100 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF, SAG, 100 ng/mL fator Neurotrophic 3 (NT3) e 25 mM KCl. Refresh o meio de todos os outros dias de 3 ng/mL. No dia 35, recolha o organoids 3D para análise. Alteração/atualização meio de diferenciação de cultura 3D Transferi o volume necessário de NMM com os componentes apropriados (ver 3.2.2-3.2.7 passos para programação de componente) para um tubo estéril. Quente em banho maria a 37 ° C. Dica da placa e agite suavemente até que as células se acerte para as extremidades inferiores dos poços. Cuidadosamente, remover 2 mL do meio antigo, usando uma pipeta sorológica, evitando a remoção das células, em seguida, adicione 2 mL de meio fresco. Incube a 37 ° C com 5% de CO2.Nota: O volume de (importante), o fim deve ser 2,5 mL/poço de 6WP. Se ocorrer evaporação, não remova 2 mL do velho médio como este iria secar ainda mais as culturas de células; em vez disso, adicione meio extra. Meio de diferenciação de alteração/atualização com separação de gravidade Transferi o volume necessário de NMM com os componentes apropriados para um tubo estéril. Quente em banho maria a 37 ° C. Transferir o conteúdo dos poços a um tubo estéril e permitir que o tubo se sentar por 10 min em RT, para separação de gravidade. Usar uma pipeta para remover o antigo médio do tubo, tomando cuidado para não remover células, Ressuspender em NMM com componentes apropriados, estabeleceu-se e depois distribuir para novos poços revestidos AA. Incube a 37 ° C com 5% de CO2.Nota: (Opcional) para sua conveniência, uma porção do meio de cultura pode ser adicionada para o destino poços antes da distribuição, com diferenciação de células resuspended em um volume menor. O volume final deve ser 2,5 mL/poço das 6WP. 4. protocolo 3: Alternativa 2D diferenciação cultura Iniciar e manter a cultura usando as etapas conforme seção 3 para protocolo 3D através de dia 12 Segui etapas 3.1-3.2.3 e médio de alteração/atualização conforme as etapas 3.3 e 3.4. Alternar para e manter como cultura monocamada 2D No dia 13 de diferenciação, siga as instruções para alterar/atualizar meio com separação de gravidade (passo 3.4), distribuir apenas células/agregados para placa PLO/LAM revestido (ver passo 1.6) com um volume final de 2,5 mL/bem de 6WP.Nota: O meio pode ser suplementado com 10 µM RI durante o chapeamento inicial para ajudar a aderência e a sobrevivência das células. (Importante) É desejável para espalhar uniformemente as células dos poços, para evitar baixa densidade ou aglomeração nas placas e a passagem (consulte a etapa 4.4) conforme necessário. O tamanho preferencial de PLO/LAM revestido de placas (i.e., 6WP, 12WP, etc.) deve ser determinado empiricamente, com base na taxa de proliferação para a linha de celular e finalidade do produto. Instruções darão volumes para 6WP e podem ser convertidas pela metade para cada duplicação do número bem (ou seja, 2 mL/bem por 6WP, 1 mL/bem para 12WP, etc) No dia 14, mude o meio de NMM com 100 ng/mL FGF8B, FGF4 de 100 ng/mL e 20 ng/mL FGF2. Atualize o meio todos os dias, conforme descrito no passo 4.3. No dia 17, mude o meio de NMM com 100 ng/mL FGF8B. Atualize o meio todos os dias, conforme descrito no passo 4.3. No dia 21, mude a médio NMM com 100 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF. Atualize o meio todos os dias, conforme descrito no passo 4.3. No dia 28, mude o meio de NMM com 100 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF, SAG de 3 ng/mL, 100 ng/mL NT3 e 25 mM KCl. Refresh o meio todos os dias, conforme descrito no passo 4.3. No dia 35, coletar as células para análise, ou manter a mesma médio como etapa 4.2.5 para cultura estendida (limite potencial não testado). Alteração/atualização meio de diferenciação de cultura 2D Transferi o volume necessário de NMM com componentes apropriados (ver 4.2.2-4.2.5 passos para programação de componente) para um tubo estéril. Quente em banho maria a 37 ° C. Aspire o meio dos poços e, em seguida, adicionar 2 mL de meio de novo. Incube a 37 ° C com 5% de CO2.Nota: (Opcional) o fim de volume pode ser mantido em 2,5 mL/bem de 6WP, usando uma pipeta para remover a 2 mL do meio velho e adicionar 2 mL de meio fresco. Reservando uma parte do velho médio nos poços e células prevenção do contato do ar, pode diminuir o choque para as células durante as etapas de mudança. Cultura de diferenciação 2D de passagem Transferir o volume necessário de NMM com os componentes apropriados (ver 4.2.2-4.2.5 passos para programação de componente) para tubos estéreis, por processo de passagem e, separadamente preparar o PLO/LAM revestido chapa para receber células passadas. Completar o meio da placa de destino com 10 µM de RI. Aqueça os tubos no RT, ou em banho maria a 37 ° C. Para economizar componentes, é possível usar o NMM sozinho para lavagem de células durante o processo de passaging.Nota: (importante) se forem usados produtos em imagens de cálcio de experimentos, certifique-se de células de passagem entre 2 a 6 dias antes do final de diferenciação. Aspire o meio de poços para ser passadas. Adicionar 300 µ l/poço de agente baseado em tripsina dissociação (ver Tabela de materiais), placa de redemoinho para cobrir os poços e, em seguida, remova imediatamente o agente de dissociação. Deixar a placa se sentar por 2 min em RT e, em seguida, solte as células tocando os lados da placa. Adicionar inibidor de 600 µ l/poço definido tripsina (DTI) e transferir as células no DTI para um tubo estéril com 5 mL NMM. Centrifugar o tubo a 290 x g, durante 15 min em RT. Aspire o meio e adicionar outro 5ml NMM ao tubo. Centrifugar o tubo a 290 x g, durante 15 min em RT. Aspire o meio e ressuspender as células em meio adequado contendo RI. Distribuir as células na placa PLO/LAM usando uma divisão relação de 1:1-1:12, dependendo a confluência inicial, taxa de proliferação e tamanho diferencial na origem para a placa de destino e manter a 37 ° C com 5% de CO2.