ونحن تصف متوسطة بروتوكول هبسكس، باستخدام تعريف تمايز 3D مبسطة وتخفيض عوامل النمو، قادرة على توليد المجاميع الخلية مع أوائل نيوروبيثيليال الهياكل وإيجابية بالنسبة لعلامات مرتبطة بالدماغ، فضلا عن اختياري 2D التعديل للتفريق بين الخلايا كأحادي الطبقة لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية.
الحد من التعقيد والتكلفة من البروتوكولات التفريق مهم للباحثين. يناسب هذا الاهتمام بالشواغل المتعلقة بالآثار غير المقصودة أن العوامل الخارجية الزخرفة يمكن إدخال الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسك) نماذج نمو الدماغ أو الفيزيولوجيا المرضية، مثل إخفاء المرض النمط الظاهري. وهنا، نقدم البروتوكولين التمايز الدماغ هبسكس، مصممة مع أبسط طريقة لبدء تشغيل، عوامل الزخرفة أقل، وأقل المتطلبات المادية من البروتوكولات السابقة. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير إجراءات الثقافة، التي تولد التعويم الحر المنتجات ثلاثي الأبعاد (3D) يتفق مع البروتوكولات الأخرى “أورجانويد” في الدماغ، بما في ذلك مورفولوجيس معيني الشكل وذات الصلة للنمذجة نمو الدماغ مثل المنطقة الفرعية/البطين- الهياكل الشبيهة بشفة. والثاني يستخدم إجراء أحادي الطبقة ملتصقة، 2D للتفريق الكامل، الذي يظهر قادرة على توليد الخلايا العصبية الدماغ الوظيفية، منتجات إيجابية للعلامات المرتبطة بالدماغ، ويحمل تدفق الكالسيوم تشبه الخلايا العصبية. معا، هذه البروتوكولات تقدم العلماء خياراً خيارات مناسبة لأغراض بحثية مختلفة، فضلا عن نموذج أساسي لاختبار أنواع أخرى من الاختلاف العصبية مبسطة.
البروتوكولات في المختبر للتفرقة بين هبسكس تجاه الأنساب الدماغ في البداية تعمل على مبدأ محاكاة3،2، في فيفو التنمية الدماغ1،4. على هذا النحو، أنها تتطلب سلسلة عوامل التي أدخلت في أوقات محددة محرك الزخرفة برو-الدماغ والنضج. كانت WNT، العظام ومن أهم هذه البروتينات مورفوجينيتيك (BMPs)، وعوامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (تعملك) مع أدوار معروفة في منتصف هيندبرين التنمية وتشكيل منظم البرزخية5،،من67. وبطبيعة الحال، كل خطوة إضافية وعامل يعني زيادة في التلاعب كثيفة العمالة وزيادة المصروفات للباحث، وحتى وضع بروتوكولات أبسط قادرة على تحقيق نتائج المساواة من مصلحة. هذه المسألة العملية ممزوج لطيف مع مسألة افتراضية، ما إذا كانت الخلايا تتطلب مثل هذا ضيق، والخارجية السيطرة على التنمية في المختبر.
للتفريق بين الدماغ، موجهة بروتوكول نشر في عام 2015 بضرورة استخدام عدد وافر من عوامل النمو باستخدام فقط FGF2، FGF19، وعامل المستمدة من الخلايا اللحمية 1 (SDF1) لأغراض8الزخرفة. كما تختلف هذه الدراسة البروتوكولات الدماغ السابقة، باستخدام نظام التعويم حر ثقافة 3D. بالإضافة إلى إنتاج الخلايا إيجابية لعلامات الدماغ، والدماغ “أورجانويدس” التي تم إنشاؤها بواسطة التقنية عرضت يحمل مورفولوجيا ذات الصلة، غير متوفرة في ثقافات أحادي الطبقة 2D التقليدية، مثل الهياكل الشبيهة بشفة معيني الشكل. على الرغم من أن أقل تعقيداً وتكلفة فيما يتعلق بعوامل النمو، ميزات أخرى مثل تشكيل الهيئات امبريويد موحدة (EBs) وثقافة في لوحات 96-جيدا (96WPs)، جعلت من الناحية الإجرائية المعقدة خلال الخطوات الأولية. بروتوكول ثلاثي الأبعاد آخر نشر في نفس العام, حسبما ذكرت التمايز ناجحة للأنساب العصبية باستخدام خلية مشتركة وغير مكلفة الثقافة تقنيات9. على الرغم من أن هذا الفريق كان يحقق القشرية بدلاً من التمايز الدماغ، يمكن أن لا تكون مخفضة تطبيق مفهومها للتمايز الدماغ.
أبلغنا مؤخرا بروتوكول تمايز الدماغ ثلاثي الأبعاد باستخدام عدد أقل من العوامل الزخرفة (أي، FGF2، 4 و 8)، فضلا عن إعداد مبسط بإبقاء الخلايا في لوحات 6-جيدا (6WPs) في جميع أنحاء التقليل إلى أدنى حد من متطلبات متوسطة10. مساعدة إنتاج الخلايا الحبيبية، استخدمت مؤثر طرية (تبلد) أثناء الخطوة النضج النهائي. تبلد هو بديل أقل تكلفة المواد كيميائية للقنفذ سونيك (SHH)، التي كانت تستخدم في وقت سابق الدماغ البروتوكولات، نظراً لدورها في تعزيز نمو الحبيبية خلية السلائف (أوتوماتية) في فيفو1،2، 11،،من1213. تمايز المنتجات كانت متسقة مع تلك من بروتوكولات أخرى ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك وجود علامات مرتبطة بالدماغ في الهياكل ذات الصلة شكلياً8،9. مثل هذه النتائج تعزيز الرسالة السابقة التي مفصلة تقليد في فيفو البيئة قد لا تكون ضرورية لبروتوكولات معقدة ثلاثية الأبعاد في المختبر التمايز.
ويصف هذا التقرير بالإضافة إلى البروتوكول 3D، بروتوكول ثنائي الأبعاد، مصمم بنفس الإعداد السريع، المواد الأساسية، وخفض عدد من عوامل النمو. هو قادر على إنتاج الخلايا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) أو بفعل الخلايا الجذعية pluripotent (هيبسكس)، وإيجابية للعلامات المرتبطة بوقت مبكر العصبية، والدماغ، والخلايا الحبيبية الهويات. وباﻹضافة إلى ذلك، تصوير الكالسيوم يدل على وجود الخلايا العصبية البشرية الفنية. القدرة على الاختيار بين البروتوكولات، ويضيف قدرا من المرونة للباحثين، للراغبين في أما: خلية معينة (1) توليد أنواع، ونمو الدماغ البشري (2) النمذجة والهياكل، (3) تحليل الأمثل في أحادي الطبقة المرتبطة إعدادات (مثلاً، تسجيلات المشبك التصحيح)، أو (4)-خلية التفاعلات في الثقافات العصبية مختلطة. طبيعتها بسيطة ومنخفضة التكلفة، يجعل منها موجوداً للباحثين الذين جديدة إلى الميدان هبسك، أو تحتاج إلى إجراءات هبسك قاعدة لاستكشاف المزيد من خيارات التفريق منه.
التعقيدات والتكاليف هي من العوامل ذات الصلة للباحثين الخلايا الجذعية عند اختيار أو وضع بروتوكولات التمايز. وهذا ينطبق بشكل خاص حيث أنها مسألة مفتوحة لمقدار التحكم الخارجي مطلوب لتوليد أنواع الخلايا المطلوب، أو – أنها تشكل بطريقة مختلفة – كيف هبسكس المختصة في إنتاج البيئة الإنمائية الخاصة بها، إذا ما تركت لنفسها كافية، مع المواد الغذائية. الأخذ بعوامل خارجية في المختبر جيد جداً قد تنتج منتجات الخلايا المطلوب، ولكن أيضا يمكن أن تتداخل مع القدرات التنموية الذاتية أن أظهرت الخلايا في الجسم الحي. هذه الاعتبارات هامة، لا سيما إذا كان الهدف استخدام إيبسكس المستمدة من المريض للنمذجة المرض. الاستخدام الواسع النطاق للزخرفة و/أو عوامل النمو يمكن أن تخفي تعمل المرض. البروتوكولات بالتفصيل في هذا التقرير اتبع هذا اتجاه الدراسات السابقة للحد من التعقيد والتكلفة، و/أو استخدام الزخرفة الخارجية عوامل8،9.
استناداً إلى النتائج التي أبلغت عنها موجوروما et al., ودراستنا الأخيرة، يبدو أنه من الممكن تحقيق التمايز تجاه مصائر الدماغ دون بذل جهود متضافرة لاستنساخها في فيفو الظروف، كما قامت بدراسات سابقة 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10-الجزء مثيرة للاهتمام أن الدراستين تستخدم مجموعات مختلفة من عوامل النمو، مما يوحي بأن أي مجموعة من الضروري، على الرغم من استخدام كل من FGF2. هربنا اختبارات إضافية، فيها تتعامل بشكل انتقائي مستبعدة من البروتوكول، وبينت أن الخلايا قادرة على توليد نفس المنتجات دون اقتراحاتك الخارجية10. الفروق بين الدراسات لدينا مؤهلة بحقيقة أن استخدمنا خطوط هبسك مختلفة وأساليب الثقافة، الناجم عن تمايز العصبية مع جمهورية أرمينيا، وتشتمل على عناصر لدعم بقاء الخلايا الحبيبية والنضج (بدنف، جدنف وتبلد وبوكل)11 –14. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت أسلوب بدء تشغيل أقل تعقيداً، بالمقارنة مع موجوروما et al.. وبدأ على البروتوكول بتوليد الحديدية موحدة في 96WPs، الذي معزولة لهم جسديا وكيميائيا عن بعضها البعض. وكان البروتوكول هنا كافة PSCs نسبيا مزدحمة معا في 6WPs أثناء تكوين المجلس التنفيذي، والتي سمحت لهم بالتفاعل بحرية. كيف هذا خلطات أثرت على البيئة الفيزيائية والكيميائية الحديدية وأورجانويدس فيما بعد (بما في ذلك إنتاج الجوهرية مما يشير إلى مركبات) غير معروف، ويمكن استكشافها. أيضا، في حين أننا إظهار التعبير عن الجينات المرتبطة ب — وتوحي بذلك – الأصل الدماغ، تقع داخل هياكل شكلياً مشابهة لتلك التي أوردها موجوروما et al.، لا يمكننا أن نستبعد جيل من الخلايا العصبية تشبه الهياكل التي هي الهوية غير الدماغ. الدراسات المستقبلية، استخدام لوحة كبيرة من الأجسام المضادة مثل تلك التي أوردها موجوروما et al. (أي، ATOH1، كالب، إلخ) من شأنه أن يجعل هذه الإحالات، والمقارنة بين المنتجات لكلا البروتوكولين، أكثر حسما.
ضمن البروتوكول ثلاثية الأبعاد، ومن المهم البدء والاحتفاظ بعدد كاف من الخلايا في الثقافة لضمان إعداد كافية من المنتجات النهائية للتحليل. نظراً ليموت قبالة كبيرة مبكرا في البروتوكول، نوصي بدءاً بأكثر من 500 بئر الحديدية/خلال أول 3 أيام في الثقافة (الشكل 1). هذا لا ينبغي أن صعوبة تحقيق أحجام مستعمرة المعطى هبسكس في ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق، ولكن قد لا يكون سهلاً لتلك التي لا تزال تستخدم أساليب تعتمد على التغذية. ونظرا للعدد الكبير من الخلايا، من المهم أن يشاهد لتغيير اللون في المتوسطة (التي تشير إلى تغيرات درجة الحموضة)، وتراكم الخلايا الميتة. ويجب تصحيح على حد سواء لمنع انهيار ثقافة. قد يكون هناك أيضا التثاقل من الخلايا والمجاميع في الهياكل الضخمة. على الرغم من أنه قد لا يزال إلى المجاميع التي يمكن تحليلها، كمية المنتج إلى حد كبير يخفض، حتى كسر منهم إلى مجاميع أصغر مع لطيف تريتوريشن يمكن أن تكون مفيدة. ومع ذلك، تجنب الخلطات طبيعية مثيرة للقلق، هي نفسها يمكن أن تنمو إلى أحجام كبيرة (الشكل 4). إذا أصبحت المجاميع قليلة جداً، فمن المستحسن للجمع بين الآبار بحيث لا تكون المجاميع معزولة تماما. تقلب المنتج (في عدد وحجم ومورفولوجيا) قضية معروفة في الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك تلك البروتوكولات بدءاً من خطوات تشكيل المجلس التنفيذي معزولة، موحدة، مما يوحي بأن إجراء بدء تشغيل أقل تعقيداً (مثل بروتوكول الموصوفة هنا ) يمكن أن تكون العملية أكثر8،15. بينما هذا التغاير هو شيء الباحثين بحاجة إلى أن نضع في اعتبارنا، لا سيما أثناء التحليل، المبلغ عنها البروتوكول إنشاء المنتجات بما يتفق مع تلك التي وجدت في الأخرى البروتوكولات 3D8،،من915. استناداً إلى حجم ومورفولوجيا، أنها تقع ضمن نطاق روزيت العصبية الدماغية أورجانويد، كما هو موضح في استعراض أجرى مؤخرا من كيلفى وجامعة لانكستر15، مع الأكثر من المناسب تصنيف كروي. ملحوظة خاصة، هي وجود هياكل ثلاثية الأبعاد توحي بمأخذ العصبية مع التجويف ومناطق البطين (الفرعية) ومعيني الشكل الشفة مثل ميزات (الشكل 5 و الشكل 6) كما حددتها جماعات أخرى8 , 15 , 16 , 17-حيث تنتج كل تجربة واحدة على الأقل التجميعية مع المفترضة VZ/سفزس وعلامات مرتبطة بالدماغ (ZIC1، KIRREL2)، تلك معايير مفيدة لتحديد نجاح التفريق 3D استخدام لدينا البروتوكول، مع مثل RL ميزات توفير دعم إضافي. تمديد طول ثقافة الماضي 35 يوما كان لم تختبر، ولكن يمكن اتباعها لتحديد أقصى حد من النمو والتعقيد، والنضج يسمح بهذا الأسلوب.
يستخدم بروتوكول ثنائي الأبعاد بنفس تشكيل المجلس التنفيذي غير ملتصقة وعملية الاستقراء العصبية كبروتوكول ثلاثي الأبعاد وحتى تنطبق أيضا التعليقات الواردة أعلاه. وبمجرد مطلي، ينبغي النظر في مجموعة مختلفة من الاعتبارات. الحديدية ينبغي أن يتقيد بسرعة للخلايا تنتشر إلى الخارج على اللوحة. إذا كانت هناك مشاكل مع الالتزام، بالإضافة لري (إذا لم تكن قد استخدمت)، خفض حجم متوسط، أو قد يتم تطبيق تغييرات تجريبية في تركيز منظمة التحرير الفلسطينية/لام. من المهم أن تبقى الخلايا من زراعة كثيفة أو قليلة جداً (يفضل أن تكون نمت بين 20-80% كونفلوينسي) في الآبار؛ الرصد اليومي وباساجينج في الوقت المناسب من المهم تجنب الخلايا كونفلوينسي أكثر أو عائمة. خلافا للبروتوكول ثلاثي الأبعاد، لا ينبغي يموت قبالة كبيرة خلال الثقافة، على الرغم من أنه قد تكون هناك مناطق ضعف النمو، أو تباطؤ معدلات انتشار. باساجينج يؤثر على حالة نضوج الخلايا (على سبيل المثال، إزالة عمليات الخلية والشبكات المتقدمة بين الخلايا) وينبغي أن يوضع في الاعتبار عند الاقتراب من النقاط حيث سيتم جمع الخلايا أو تحليلها على نحو ما. على سبيل المثال، للكالسيوم التصوير فإنه من المهم جداً خلايا المرور بين 2-6 أيام قبل التحليل. باساجينج قريبة جداً من التحليل قد يعني الخلايا لم يتح الوقت للاتصال و/أو ناضجة، وبعيدا جداً قد تؤدي إلى خلايا الاكتظاظ، مما يجعل التصوير صعباً. على الرغم من أن قد يوجد تباين بين التجارب، نتائج تتسق مع تلك التي أبلغ عنها في البروتوكولات الدماغ الأولية في 2D1،2. تحليل التعبير تلطيخ والجينات في المحكمة الجنائية الدولية تؤكد وجود خلايا إيجابية بالنسبة لعلامة خلية الحبيبية ZIC1، بينما أيضا تحديد علامات المرتبطة مع الهويات الأخرى العصبية والدماغ (الشكل 7 و الشكل 8). تصوير الكالسيوم، الذي ينطوي على التحفيز الكهربائي للخلايا المحتضنة مع صبغة fluor5، أشارت إلى نشاط الخلايا العصبية الوظيفية (الشكل 9و تكميلية الرقم 1، و الإضافي رقم 2)، على الرغم من أنه لم يتم تأكيد إذا كانت هذه وكانت الخلايا الحبيبية. ويمكن القول أن بإعطاء المزيد من الوقت خلايا ناضجة بتمديد فترة ثقافة الماضي 35 يوما، ينبغي زيادة حجم نشاط الخلايا العصبية الوظيفية. ويمكن استكشاف هذه الإمكانية في المستقبل.
بالإضافة إلى خطوط البحوث المقترحة أعلاه، سيكون من اهتمام لتحديد الاختلافات في الهويات المنتج (كمية ونوعية) بين البروتوكولات 2D و 3D. أهمية اقتراحاتك الخارجية كان لم تختبر في 2D البروتوكول، وسيكون من المفيد أن نعرف إذا كان الافتقار إلى هيكل ثلاثي الأبعاد بعد الطلاء، وحتى مسارات الإشارات المرتبطة بها، أن تجعل الثقافات 2D أكثر أو أقل اعتماداً على تلك الزخرفة أوائل المركبات. أكثر البروتوكولات تجريد لأسفل (مثل، لا جمهورية أرمينيا، بدنف، تبلد) بنفس القدر خطوط معقولة لإجراء مزيد من التحقيقات. وأخيراً، الدراسات المستقبلية قد تستفيد من أدوات البحث الجديدة لأفضل وصف (وتقييم كفاءة توليد) المخططات العصبية الدماغ الخاصة بالإنسان.
مع تحذيرات معينة في الاعتبار، سواء ذكرت يمكن استخدام بروتوكولات للاختلاف الدماغ، مع منتجات ملائمة لأغراض مختلفة. أنها قد تخدم كنقطة انطلاق عملية للباحثين إجراء الدراسات التجريبية واختبار صلاحية خطوط الخلايا لمثل هذا الاختلاف، أو كنموذج أساسي لأنواع أخرى من تمايز العصبية المستهدفة.
The authors have nothing to disclose.
نحن ممتنون جاكوبس جيربرين وبرويكي جورجين لمساعدتها التقنية الخبراء، إلى بريسكا ليفيرينك للمساهمة في توليد وتوصيف لمراقبة اللجنة التوجيهية سطرين، وليزا جاسباروتو لإظهار إجراءاتنا.
DMEM/F12+Glutamax | Gibco | 31331-028 | glutamine fortified DMEM/F12 |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | neural basic medium |
N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
B27 supplement | Gibco | 17504001 | |
Insulin | Imgen | PT468-B | |
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma | P3932 | aka Poly-Hema |
Laminin | Sigma | L2020 | |
E8 medium and supplement | Gibco | A1517001 | hPSC medium and supplement |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
y-27632 (ROCK inhibitor) | SelleckChem | S1049-10mg | |
DMSO | Sigma | D-2650 | |
Geltrex | Gibco | A1413302 | hPSC-appropriate adherent coating (PAAC) |
0,5M EDTA | Gibco | 15575-020 | |
0.2 um filter | VWR | 28145-77 | |
1.5 mL Eppendorf tube | VWR | 525-0130 | |
DMEM/F12 | Gibco | 21331-020 | |
Ethanol | VWR | 83804360 | |
Parafilm | Sigma | PM996 | wrap for culture plates |
cryotubes | ThermoFisher | 368632 | |
TrypLE | Gibco | 12563-029 | trypsin-based dissociation agent |
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R-007-100 | |
FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
FGF-4 | R&D Systems | 100-31 | |
FGF-8B | Peprotech | 100-25 | |
Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
Brain Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-02 | |
Glial Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | |
Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
Neurotrophic Factor 3 | Peprotech | 450-03 | |
Smoothened Agonist (SAG) | Cayman | 11914 | CAS 912545-86-9 |
Axiovert 40C microscope | Zeiss | Brightfield imaging microscope | |
Axiocam | Zeiss | Brightfield imaging – image aquisition | |
Eppendorf Centrifuge 5810 | Eppendorf | 521-0996 | centrifuge for cell culture |
PBS (gebufferde natrium oplossing) | Braun Medical | 3623140 | |
5 ml Serological pipets | VWR | 612-4950 | |
10 ml Serological pipets | VWR | 612-4951 | |
6-wells culture plates | VWR | 734-2323 | |
12-wells culture plates | VWR | 734-2324 | |
hESCs | WiCELL | line H01 |