İsteğe bağlı 2D değişiklik ile akıcı 3D serebellar farklılaşma Protokolü
Summary
Biz bir basitleştirilmiş 3D farklılaşma tanımlanan protokolü kullanarak hPSCs, orta tarif ve büyüme faktörleri, erken neuroepithelial yapıları ile hücre toplamları oluşturma yeteneğine ve serebellar ilişkili işaretçileri, hem de bir isteğe bağlı için olumlu azaltılmış Hücreleri işlevsel sinir hücreleri oluşturmak için monolayer ayırt için 2D değişiklik.
Abstract
Karmaşıklık ve farklılaşma protokolleri maliyetini azaltarak araştırmacılar için önemlidir. Bu faiz olası istenmeyen etkileri dışsal desenlendirme faktörler model beyin gelişimi ya da hastalık fenotip maskeleme gibi patofizyolojisi, insan pluripotent kök hücre (hPSC) oluşturabileceğine kaygıları ile uyuyor. Burada, iki serebellar farklılaşma protokol için tasarlanmış basit başlangıç yöntemini, daha az desenlendirme faktörler ve daha az önceki iletişim kuralları daha malzeme gereksinimleri hPSCs, mevcut. Son zamanlarda, biz serbest yüzer 3 boyutlu (3D) ürünleri beyin “organoid” iletişim kuralları türleri Morfoloji beyin gelişimi gibi alt/ventrikül bölge – modelleme ile ilgili ve rhombic de dahil olmak üzere diğer tutarlı oluşturmak kültür yordamlar geliştirilen dudak benzeri yapılar. İkinci ürün serebellar ilişkili işaretçileri için olumludur ve nöron benzeri kalsiyum influxes sergilemek gibi fonksiyonel serebellar nöronlar, üretme yeteneğine sahip gösterilir tam farklılaşma yapışık, 2D monolayer yordamına kullanır. Birlikte, bu protokoller bilim adamları aerodinamik sinirsel saptamaları diğer türleri test etmek için farklı araştırma amaçlı, hem de bir temel modeli için uygun seçenekleri sunuyoruz.
Introduction
Vitro iletişim kuralları hPSCs serebellar soy doğru başlangıçta differentiating için in vivo Serebellar geliştirme1,2,3,4taklit eden ilke üzerine işletilen. Bu nedenle, onlar bir arkaya faktörlerin sürücü pro serebellar desenlendirme ve olgunlaşma için belirli zamanlarda tanıttı gerekli. Bunlar arasında Şef WNT, vardı kemik morfogenetik proteinler (BMP) ve orta arka beyin gelişimi ve oluşumu isthmic Organizatör5,6,7bilinen rolleri ile fibroblast büyüme faktörleri (FGFs). Tabii ki, her ek adım ve faktör emek yoğun işlemler ve daha fazla gider bir artış için araştırmacı anlamına gelir, ve çok daha basit protokolleri eşit sonuçları ulaşma yeteneğine sahip gelişmekte olan ilgi. Hücreleri üzerinde kendi geliştirme içinde vitroböyle sıkı, dış denetim gerektiren olup olmadığını pratik bu sorun güzel varsayımsal soru ile dovetails.
Serebellar farklılaşma için 2015 yılında yayınlanan bir protokol amacıyla8desenlendirme için sadece FGF2, FGF19 ve stromal hücre kaynaklı faktörü 1 (SDF1) kullanarak büyüme faktörlerinin geniş bir numarasını kullanarak gerekliliği ele. Bu çalışma aynı zamanda bir serbest yüzer 3D kültür sistemi kullanılarak önceden serebellar kurallarından farklıydı. Serebellar işaretçileri için hücreleri olumlu üreten ek olarak, “kendi tekniği ile üretilen beyin organoids” ilgili Morfoloji, rhombic dudak benzeri yapıları gibi geleneksel 2D monolayer kültürlerde kullanılamaz sergilemek gösterilmiştir. Daha az karmaşık ve pahalı büyüme faktörleri, tek tip embryoid organları (EBs) ve 96-şey tabak (96WPs), kültür gibi diğer özellikleri ile ilgili olarak her ne kadar ilk adımları uyguladığınızda procedurally karmaşık yaptı. Başka bir 3D protokol aynı yıl yayınlanan, sinirsel soy yaygın ve ucuz hücre kültürü teknikleri9kullanarak için başarılı farklılaşma bildirdi. Her ne kadar bu grup serebellar farklılaşma yerine kortikal araştırıyordu, uygulama serebellar farklılaşma için onların kavramının indirimli değil.
Biz son zamanlarda desenlendirme faktörlerin azaltılmış bir kullanan bir 3D serebellar farklılaşma Protokolü rapor (yani, FGF2, 4 ve 8), yanı sıra boyunca orta gereksinimleri10en aza indirmek için 6-şey levha (6WPs) hücreleri tutarak basitleştirilmiş bir Kur. Granül hücrelerinin üretimini yardımcı olmak için smoothened agonist (SAG) son olgunlaşma adımı sırasında kullanıldı. SAG olduğunu daha önce serebellar protokolleri, granül hücre öncüleri (GCPs) vivo1,2, büyüme teşvik rolü nedeniyle kullanmıştı sonic kirpi (SHH), daha az pahalı bir kimyasal alternatif 11,12,13. Farklılaşma ürünleri serebellar ilişkili işaretçileri varlığı morfolojik ilgili yapıları8,9‘ da dahil olmak üzere diğer 3D protokollerinden gelen tutarlı edildi. Böyle sonuçlar asla bilemeycek ayrıntılı önceki mesajı takviye vivo çevre karmaşık 3D vitro farklılaştırma protokolleri için gerekli olmayabilir.
3D protokolüne ek olarak, bu rapor aynı hızlı kurulum ile temel malzemeler, tasarlanmış bir 2D protokolünü açıklar ve büyüme faktörleri sayısını azalttı. Bu insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) hücrelerden üretebilen veya pluripotent kök hücreler (hiPSCs) indüklenen, işaretçileri için olumlu associated ile erken sinirsel, serebellar ve granül hücre kimlikleri. Buna ek olarak, kalsiyum görüntüleme fonksiyonel insan nöronlar varlığını gösterir. Araştırmacılar, ya da bu ilgi için protokolleri arasında seçmek için yetenek ekler bir düzeyde bir esneklik: (1) üreten belirli hücre türleri, (2) modelleme insan beyin gelişimi ve ilişkili yapıları, (3) analiz monolayer içinde en iyi duruma getirilmiş ayarlar (örneğin, yama-kelepçe kayıtları) veya (4) hücre-hücre etkileşimleri karışık sinirsel kültürlerde. Basit ve düşük maliyetli doğaları onları erişilebilir hPSC alana yeni veya temel hPSC yordamlar daha fazla farklılaşma seçenekleri keşfetmek için gerek araştırmacılar için yapar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Karmaşıklığı ve maliyeti seçerek veya farklılaşma protokoller geliştirme kök hücre araştırmacılar için ilgili faktörlerdir. Ne kadar dış denetim istediğiniz hücre tipleri, üretmek için gerekli olan bir açık soru olduğu gibi bu özellikle doğrudur ya da — farklı poz için — yetkili hPSCs kendi gelişim ortamı üreten kendilerini yeterli ile bırakılırsa ne kadar besin. Extrinsic etkenler vitro getirilmesi çok iyi istediğiniz hücre ürünleri üretmek, ama onlar da engelleyebilir içsel gelişim kapasiteleri ile hücre içinde vivosergiledik. Böyle konuları, özellikle eğer amaç hastalığı modelleme için hasta kaynaklı iPSCs kullanılması önemlidir. Yoğun kullanımı desenlendirme ve/veya büyüme faktörleri, hastalık fenotipleri maske. Bu raporda detaylı protokollerin karmaşıklığı, maliyet ve/veya dışsal desenlendirme faktörler8,9kullanımını azaltmak için önceki çalışmalarda trendi takip.
Muguruma vd., ya da bizim kendi yeni çalışma tarafından bildirilen sonuçlara dayanarak, göründüğü gibi daha önceki çalışmalar yaptık farklılaşma serebellar kader in vivo koşullarda, çoğaltmak uyumlu çabaları olmadan doğru ulaşmak mümkündür 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. en ilgi çekici kısmı iki çalışma farklı büyüme faktörleri, hem de FGF2 kullanılabilir olsa da ben de kümesi gerekli, düşündüren bir kümesi kullanılır. Biz nerede FGFs seçerek iletişim kuralından hariç ve hücreleri dışsal FGFs10olmadan aynı ürünler üretme yeteneğine sahip olduğunu gösterdi ek testler yaptım. Çalışmalarımız arasındaki farklar gerçeği biz, farklı hPSC hatları ve kültür yöntemleri kullanılan sinir farklılaşma RA ile indüklenen ve granül hücre hayatta kalma ve olgunlaşma (BDNF, GDNF, SARKMA ve KCL) desteklemek için bileşenleri dahil tarafından nitelikli11 –14. Buna ek olarak, için Muguruma vd., kıyasla daha az karmaşık bir başlangıç yöntemini istihdam edildi. Onları fiziksel ve kimyasal olarak birbirinden izole 96WPs üniforma EBs oluşturarak onların Protokolü başladı. İletişim kuralı tüm PSC’ler nispeten birlikte 6WPs içinde onları serbestçe etkileşimine izin EB oluşumu sırasında kalabalık vardı. Nasıl Bu differentially EBs ve daha sonra organoids (bileşikleri sinyal içsel üretim de dahil olmak üzere) fiziksel ve kimyasal ortamının etkilemiş olabilir bilinmeyen ve keşfedilmeyi. Biz ifade gösterirken aynı zamanda, genler ile ilişkili — ve çok düşündüren — serebellar kökeni, morfolojik benzer yapıları içinde yer alan rapor tarafından Muguruma vd., biz cant hariç nesil nöronal benzeri yapıları serebellar kimliği vardır. Gelecekteki çalışmaları, antikorlar bu gibi büyük bir panelini kullanarak Muguruma vd tarafından bildirilen (Yani, ATOH1, CALB, vb) bu tür atamaları ve her iki iletişim kurallarını, daha kesin ürünleri arasında karşılaştırma yapar.
3D iletişim kuralına ile başlamak önemlidir ve hücre kültürü son ürün analiz için yeterli sayıda sağlamak için yeterli sayıda korumak. Önemli die-off erken protokolünde göz önüne alındığında, EBs/iyi sırasında kültür (şekil 1) ilk 3 günde fazla 500 ile başlayan öneririz. Bu hPSCs besleyici-Alerjik kültür için verilen koloni boyutları elde etmek zor olmamalı ama hala besleyici bağımlı yöntemleri kullanarak bu kadar kolay olmayabilir. Hücreleri çok sayıda göz önüne alındığında, bu renk değişikliği (pH değişiklikleri gösteren) orta ve ölü hücreleri birikimi izlemek önemlidir. Her ikisi de kültür çöküşü önlemek için düzeltilmiş olması gerekir. Ayrıca olabilir hücreleri ve toplamları topaklanma büyük yapılar. Her ne kadar hala çözümlenebilir toplamları neden olabilir, böylece onları daha küçük toplamları ile nazik toz içine ayrılıyor yararlı olabilir ürün miktarı büyük ölçüde, azalacaktır. Ancak, rahatsız edici normal agrega, kaçının hangi kendilerini büyüyebilir büyük boyutlarda (şekil 4). Toplamları çok seyrek olur, böylece toplamları tamamen izole değildir kuyu birleştirmek için önerilir. Ürün arasındaki değişkenlik (sayısı, boyutu ve Morfoloji) 3D hücre kültürü, düşündüren izole, tek EB oluşumu adımları ile daha az karmaşık bir başlatma yordamını (burada açıklanan Protokolü gibi başlayan bu protokoller için de dahil olmak üzere iyi bilinen bir sorundur ) daha pratik8,15olabilir. Bu heterojenlik araştırmacılar, özellikle analizi sırasında unutmayın gereken bir şey ise bildirilen Protokolü ürünleri diğer 3D protokolleri8,9,15‘ te bulunanlar ile tutarlı oluşturulan. Boyutu ve Morfoloji dayalı, sinirsel rozet aralığı içinde beyin organoid için küresel sınıflandırılması uygun en Kelava ve Lancaster15tarafından son incelemede açıklandığı gibi düşerler. Özellikle dikkate değer, 3D yapılar varlığını düşündüren lümen, (alt) ventrikül bölgeleri ve rhombic-rını özellikleri gibi sinirsel rozet (şekil 5 ve şekil 6) tarafından tanımlandığı gibi diğer grupları8 , 15 , 16 , 17. her deney en az bir üretilen bu yana toplam sözde VZ/SVZs ve serebellar ilişkili işaretçileri (ZIC1, KIRREL2), RL benzeri ile bizim iletişim kuralını kullanarak 3D ayırt etme başarısını belirlemek yararlı ölçütleri Bunlar ek destek sağlayan özellikler. Kültür uzunluğu 35 gündür uzanan test değil ama büyüme, karmaşıklık ve olgunluk bu tekniği ile izin verilen azami ölçüde belirlemek için takip.
2D protokolü aynı yapışık olmayan EB oluşumu ve sinirsel indüksiyon işlemi 3D iletişim kuralı olarak kullanır ve bu nedenle belgili tanımlık yorum yukarıda da geçerli. Bir kez kaplama, dikkat edilmesi gereken noktalar farklı bir dizi düşünülmelidir. EBs hızlı bir şekilde dışa tabağa çoğalırlar hücreler için uygun olmalıdır. Bağlılık, RI, (zaten kullanılıyorsa) eklenmesi ile ilgili sorunlar orta hacmi azaltılmış veya PLO/LAM konsantrasyon deneysel yapılan değişiklikler geçerli varsa. Hücre büyümesini çok yoğun ya da seyrek (tercihen 20-%80 confluency arasında Yetişkin) tutmak önemlidir Wells; günlük izleme ve zamanında passaging bitti-confluency ya da yüzen hücreleri önlemek önemli. 3D Protokolü olmamalıdır önemli die-off kültür sırasında olabilir rağmen zavallı gelişim alanları veya bir nükleer silahların yayılmasına karşı oranları yavaşlama. Passaging hücreleri (örneğin, hücre oluşum ve Gelişmiş ağ hücreleri arasında kaldırma) olgunlaşma durumunu etkiler ve nerede hücreleri toplanan veya bir şekilde analiz Puan yaklaşırken göz önünde tutulmalıdır. Örneğin, kalsiyum için bu düşsel analiz önce 2-6 gün arasında geçiş hücrelere önemlidir. Yakın passaging analiz hücreleri bağlamak için zamanım olmadı ve/veya olgun ve çok uzak aşırı kalabalık, görüntüleme zorlaştırır hücrelerde neden olabilir anlamına gelebilir. Deneyler arasında değişkenlik var olabilir rağmen ilk 2D serebellar protokolleri1,2‘ bildirdi tutarlı sonuçlarıdır. ICC boyama ve gen ifade analizi de diğer sinir ve serebellar kimlikleri ile (Şekil 7 ve şekil 8) ilişkili işaretçileri belirlenmesi sırasında hücreleri için granül hücre işaretçisi ZIC1, pozitif varlığını doğrulamaktadır. Fluor5 boya ile inkübe hücrelerinin elektriksel stimülasyon içerir, kalsiyum görüntüleme belirtilen işlev nöronal aktivite (Şekil 9, ek resim 1ve tamamlayıcı Şekil 2) değil doğruladı rağmen eğer bu Granül hücreleri vardı. Hücreleri daha fazla zaman veren Kültür uzunluğu 35 gündür genişleterek olgun tarafından fonksiyonel nöronal aktivite miktarı artırmalıdır tartışılabilir. Bu potansiyeli gelecekte keşfedilmeyi.
Yukarıda önerilen araştırma satır ek olarak, bu ürün kimliklerini (miktar ve kalite) farklılıkları belirlemek için ilgi 2D ve 3D iletişim kuralları arasında olacak. Dışsal FGFs önemini 2D protokolünde test değil ve eğer bilmek yararlı olacaktır kaplama sonra 3D yapısını eksikliği ve çok ilişkili sinyal yollar yapmak istiyorum 2D kültürler erken bileşikler biçimlenme üzerindekiler daha fazla veya daha az bağımlı. Daha fazla stripped-down iletişim kurallarını (örneğin, hayır RA, BDNF, SARKMA) aynı derecede daha fazla araştırma yapılması için makul satırları vardır. Son olarak, gelecekteki çalışmaları daha iyi karakterize (ve üretimi verimliliğini değerlendirmek için) yeni araştırma araçlardan yararı olabilir insan özgü serebellar nöronal alt türlerinden.
Akılda verilen uyarılar ile her ikisi de farklı amaçlar için uygun ürünlerle serebellar saptamaları için kullanılabilir iletişim kurallarını bildirdi. Onlar pilot çalışma, yürütmektedir araştırmacılar hücre hatları için böyle saptamaları veya hedeflenen sinirsel farklılaşma diğer türleri için temel bir model olarak canlılık test için pratik başlangıç noktası hizmet verebilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gerbren Jacobs ve Jurjen Broeke için onların uzman teknik destek, Prisca üretimi ve karakterizasyonu iki kontrol IPSC şeritleri ve Lisa Gasparotto için prosedürlerimiz gösteren için katkıda bulunmak için Leferink için sana şükrediyoruz.
Materials
| DMEM/F12+Glutamax | Gibco | 31331-028 | glutamine fortified DMEM/F12 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | neural basic medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504001 | |
| Insulin | Imgen | PT468-B | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma | P3932 | aka Poly-Hema |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| E8 medium and supplement | Gibco | A1517001 | hPSC medium and supplement |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| y-27632 (ROCK inhibitor) | SelleckChem | S1049-10mg | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | hPSC-appropriate adherent coating (PAAC) |
| 0,5M EDTA | Gibco | 15575-020 | |
| 0.2 um filter | VWR | 28145-77 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | VWR | 525-0130 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331-020 | |
| Ethanol | VWR | 83804360 | |
| Parafilm | Sigma | PM996 | wrap for culture plates |
| cryotubes | ThermoFisher | 368632 | |
| TrypLE | Gibco | 12563-029 | trypsin-based dissociation agent |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R-007-100 | |
| FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
| FGF-4 | R&D Systems | 100-31 | |
| FGF-8B | Peprotech | 100-25 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-02 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
| Neurotrophic Factor 3 | Peprotech | 450-03 | |
| Smoothened Agonist (SAG) | Cayman | 11914 | CAS 912545-86-9 |
| Axiovert 40C microscope | Zeiss | Brightfield imaging microscope | |
| Axiocam | Zeiss | Brightfield imaging – image aquisition | |
| Eppendorf Centrifuge 5810 | Eppendorf | 521-0996 | centrifuge for cell culture |
| PBS (gebufferde natrium oplossing) | Braun Medical | 3623140 | |
| 5 ml Serological pipets | VWR | 612-4950 | |
| 10 ml Serological pipets | VWR | 612-4951 | |
| 6-wells culture plates | VWR | 734-2323 | |
| 12-wells culture plates | VWR | 734-2324 | |
| hESCs | WiCELL | line H01 |
References
- Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).
- Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2012).
- Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells. Dev Biol. 290, 287-296 (2006).
- Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).
- Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain–hindbrain development. Trends Genet. 12, 15-20 (1996).
- Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).
- Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. Fetal and Neonatal Physiology. , (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Rep. 10, 537-550 (2015).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12, 671-678 (2015).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6, 402-406 (2017).
- Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).
- Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129, 1435-1442 (2002).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).
- Englund, C., et al. Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J Neurosci. 25, 247-251 (2005).
- Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, 782-789 (2011).
