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Developmental Biology

Protocollo di differenziazione cerebellare 3D semplificata con modifica 2D opzionale

Published: December 09, 2017
doi:
10.3791/56888
,
1Department of Pediatrics/Child Neurology, Amsterdam Neuroscience,VU University Medical Center, 2Department of Complex Trait Genetics, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience,Vrije Universiteit Amsterdam

Summary

Descriviamo un mezzo di protocollo per hPSCs, utilizzando definito di differenziazione 3D semplificato e ridotto di fattori di crescita, in grado di generare aggregati cellulari con prime neuroepithelial strutture e positive per marcatori cerebellare-collegata, come pure un optional Modifica 2D per differenziazione delle cellule come un monostrato per generare neuroni funzionali.

Abstract

Ridurre la complessità e il costo dei protocolli di differenziazione è importante per i ricercatori. Questo interesse si adatta con le preoccupazioni circa possibili effetti non intenzionali che fattori estrinseci patterning potrebbero introdurre in cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) modelli di sviluppo del cervello o di patofisiologia, come mascheramento fenotipo della malattia. Qui, presentiamo due protocolli di differenziazione cerebellare per hPSCs, progettato con metodo di avvio più semplice, meno fattori di patterning e meno richieste di materiale rispetto ai protocolli precedenti. Recentemente, abbiamo sviluppato procedure di cultura, che generano digalleggiante 3-dimensionale (3D) prodotti coerenti con altri protocolli di “organoid” del cervello, tra cui morfologie rilevanti per lo sviluppo del cervello come sub/ventricolare zona – di modellazione e rombiche labbro-come le strutture. La seconda utilizzata una routine monostrato aderente, 2D alla completa differenziazione, che si è dimostrata in grado di generare neuroni cerebellari funzionali, come prodotti sono positivi per gli indicatori cerebellare-collegata ed esibiscono gli afflussi del neurone-come calcio. Insieme, questi protocolli offrono gli scienziati una scelta di opzioni adatte a scopi di ricerca differenti, come pure un modello base per testare altri tipi di differenziazioni neurale semplificate.

Introduction

Protocolli in vitro per la differenziazione hPSCs verso cerebellare lignaggi inizialmente operato sul principio di che imita in vivo sviluppo cerebellare1,2,3,4. Come tali, hanno richiesto una serie di fattori a qualcuno di presentarti a orari specifici per guidare la maturazione e pro-cerebellare patterning. Primo fra questi erano WNT, bone morphogenetic proteins (BMPs) e fattori di crescita del fibroblasto (FGFs) con ruoli noti Mid-hindbrain sviluppo e formazione di isthmic organizzatore5,6,7. Naturalmente, ogni ulteriore passaggio e fattore significa un aumento in manipolazioni alta intensità di lavoro e una maggiore spesa per il ricercatore, e così lo sviluppo di protocolli più semplici in grado di raggiungere risultati uguali è di interesse. Questo problema pratico ben combacia con la domanda ipotetica, se le cellule richiedono tale controllo stretto, esterno sul loro sviluppo in vitro.

Per differenziazione cerebellare, un protocollo pubblicato nel 2015 ha affrontato la necessità di utilizzare un vasto numero di fattori di crescita utilizzando solo FGF2, FGF19 e fattore di cellula-derivato stromal 1 (SDF1) per patterning fini8. Questo studio inoltre hanno differito da precedenti protocolli cerebellare, utilizzando un sistema di coltura 3D digalleggiante. Oltre a produrre cellule positive per marcatori cerebellare, il cervello “organoids” generato dalla loro tecnica sono stati indicati per esibire morfologia pertinente, non disponibile in colture monostrato 2D tradizionale, quali rombiche labbro-come le strutture. Anche se meno complesso e costoso riguardo ai fattori di crescita, altre caratteristiche quali la formazione di corpi embryoid uniformi (EBs) e cultura in piastre da 96 pozzetti (96WPs), rendeva proceduralmente complessa durante i primi passi. Un altro protocollo 3D pubblicato lo stesso anno, segnalato successo differenziazione neurale lignaggi utilizzando cella comune e poco costoso cultura tecniche9. Anche se questo gruppo stava indagando corticale piuttosto che di differenziazione cerebellare, applicazione del loro concetto di differenziazione cerebellare potrebbe non essere scontato.

Recentemente abbiamo segnalato un protocollo di differenziazione cerebellare 3D utilizzando un ridotto numero di fattori di campitura (vale a dire, FGF2, 4 e 8), così come una configurazione semplificata mantenendo le cellule in piastre da 6 pozzetti (6WPs) tutto il tempo per ridurre al minimo i requisiti medi10. Per facilitare la produzione di cellule del granello, levigato agonista (SAG) è stato utilizzato durante la fase di maturazione finale. L’abbassamento è un’alternativa meno costosa di chimica di sonic hedgehog (SHH), che era stato usato in precedenza cerebellare protocolli, dovuto il relativo ruolo nel promuovere la crescita dei granuli delle cellule precursori (GCPs) in vivo1,2, 11,12,13. Prodotti di differenziazione erano costanti con quelli di altri protocolli 3D, compresa la presenza di marcatori cerebellare-collegata in strutture morfologicamente competenti8,9. Tali risultati rafforzano il messaggio precedente che dettagliate mimetismo di nella vivo ambiente potrebbe non essere necessario per i protocolli complessi 3D in vitro di differenziazione.

Oltre al protocollo 3D, questo rapporto descrive un protocollo 2D, progettato con la stessa configurazione rapida, materiali di base e ridotto numero di fattori di crescita. È in grado di produrre cellule staminali embrionali umane (hESC) o indotta da cellule staminali pluripotenti (hiPSCs), positivo per gli indicatori associati all’inizio neurale, cerebellare e identità delle cellule del granello. Inoltre, la formazione immagine del calcio indica la presenza di neuroni umani funzionali. La possibilità di scegliere tra protocolli, aggiunge un livello di flessibilità per i ricercatori, per coloro che sono interessati in entrambi: (1) generazione cellulari specifici tipi, lo sviluppo del cervello umano (2) modellazione e strutture, (3) analisi ottimizzato nello strato monomolecolare associate le impostazioni (ad es., registrazioni di patch-clamp), o (4) interazioni cellula-cellula in colture miste neurale. Loro natura semplice e a basso costo li rende accessibili per i ricercatori che sono nuovi al campo hPSC, o hanno bisogno di procedure di hPSC base da cui partire per esplorare ulteriormente le opzioni di differenziazione.

Protocol

1. preparati Nota: Per tutti i passaggi Vedi Tabella materiali per elementi specifici. Preparare il terreno di coltura hPSC 500ml definito per hPSC culturaNota: Utilizzare il mezzo per la procedura 2.1-2.6. Scongelare hPSC medio integratore durante la notte (o/n) a 4 ° C. Rimuovere 12,5 mL di terreno base hPSC dalla bottiglia media, quindi aggiungere 10 mL di supplemento e a 2,5 mL (facendo 100 U/L) penicillina/streptomicina (Pen/Strep) alla bottiglia. Conservare a 4 ° C e consumare entro 2 settimane.Nota: Il mezzo di hPSC può essere utilizzato per bloccare giù le cellule con l’aggiunta di 10 µM ROCK inibitore (RI) e 10% DMSO. Preparare mezzo di manutenzione neurale 1L (NMM) per la cultura di differenziazioneNota: Utilizzare il mezzo per la procedura 3.1-4.4. Glutamina mix fortificato DMEM/F12 e terreno base neurale (rapporto 1:1) in una L 1 bottiglia, poi supplemento con supplemento N2 (1x), (1x) supplemento B27, 5 µ g/mL insulina, 1,5 mM L-Glutammina, 100 µM aminoacidi non essenziali (NEAA), 100 U/L Pen/Strep e 10 µM beta-mercaptoetanolo. Conservare medie a 4 ° C e consumare entro 3 settimane.Nota: Prima di aggiungere supplementi misto medio basale, rimuovere il volume appropriato per regolare il volume richiesto di componenti aggiunti basato sulle concentrazioni nel magazzino. Preparare 500 mL di soluzione di lavoro di 0,5 mM EDTA per passaggio hPSCsNota: Utilizzare media ai punti 2.4 e 2.5. Sotto una cappa a flusso, trasferire 49 mL di Phosphate Buffered Saline (PBS) da una bottiglia da 500 mL di PBS sterile in un tubo da 50 mL. Aggiungere 0,5 mL di EDTA 0.5M e 0,9 g NaCl al tubo 50 mL. Mescolare delicatamente per sciogliere. Filtro-sterilizzare soluzione utilizzando un filtro di 0,22 µm e trasferimento alla bottiglia 500 mL di PBS sterile. Conservare a temperatura ambiente (TA). Preparare piatti di coltura hPSC hPSC culturaNota: Utilizzare piastre per passi 2.1-2.6. Fare 50 x soluzione di lavoro del rivestimento aderente hPSC-del caso (PANDIN): scongelare una fiala di PANDIN o/n a 4 ° C. Diluire PANDIN in rapporto 1:1 con DMEM/F12 e trasferimento come aliquote di 400 µ l in provette da 1,5 mL. Conservare la soluzione di lavoro 50 x PANDIN a-80 ° C.Nota: (importante) PANDIN solidifica rapidamente a RT, pertanto è necessario che tutti i componenti (DMEM, tubi, ecc.) sono tenuti su ghiaccio (o a 4 ° C). Scongelare il tubo di 50 x lavoro soluzione PANDIN a 4 ° C, quindi diluire 50 x in DMEM/F12 freddo. Aggiungere 750 µ l/pozzetto di PANDIN diluito a un 6WP. Incubare la piastra per almeno 1 h a 37 ° C.Nota: Piastre PANDIN possono essere conservati per 1 settimana a 4 ° C, avvolgendo la piastra dopo il periodo di incubazione di 1 h. Piastra calda a 37 ° C prima dell’uso. Preparare piastre anti-adesivo (AA) per la cultura di differenziazioneNota: Utilizzare piastre per passi 3.1-4.1. Fare 5 mg/mL poli (2-idrossietil metacrilato) soluzione (poly-HEMA) nel 95% etanolo. Agitare o/n a 37 ° C fino ad ottenuta una soluzione limpida. Conservare a RT.Nota: Filtrazione attraverso un filtro di 0,22 µm può rimuovere indisciolte poly-HEMA. Aggiungere poly-HEMA per la piastra di coltura in modo che copra il fondo dei pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C per 2 giorni e ispezionare la piastra per garantire la completa evaporazione del liquido/uniforme rivestimento dei pozzi. Piastre di AA possono essere avvolto e conservati a TA. Preparare piatti di poli-L-ornitina/laminina (PLO/LAM) per la cultura di differenziazioneNota: Utilizzare piastre per passi 4.2-4.4. Ricoprire la superficie dei pozzetti, utilizzando 20 µ g/mL PLO disciolto in PBS sterile. Incubare la piastra o/n a 37 ° C. PLO di aspirare e lavare 3 volte con PBS.Nota: (Facoltativo) Incubated piastra con OLP può essere avvolto e conservato a 4 ° C fino a quando necessario. Ricoprire le superfici dei pozzetti rivestite con PLO, usando 10 µ g/mL LAM disciolto in PBS sterile. Incubare per almeno 2 ore a 37 ° C o o/n a 4 ° C. LAM di rimuovere e lavare pozzetti 2-3 volte con PBS, quindi immediatamente aggiungere supporto adeguato e/o cellule.Nota: Soluzione rimosso LAM (opzionale) può essere conservato a 4 ° C e riutilizzato fino a 2 volte. (Importante) Non lasciare asciugare fuori; le superfici rivestite con LAM per evitare questo immediatamente aggiungere PBS o mezzo appropriato.   2. il protocollo 1: Privo di alimentatore hPSC cultura Nota: hESCs sono state ottenute da un’organizzazione non-commerciale (linea H01, Vedi Tabella materiali). Tre linee di controllo hiPSC (hvs51, 60 e 88) sono stati generati da riprogrammazione di fibroblasti da tre pazienti umani sani (fibroblasti erano derivate da donatori anonimi, non identificabili e pertanto esenti dall’approvazione IRB)10, 17. Mantenere hPSCs nella cultura senza alimentatore Dopo lo scongelamento e placcatura hPSCs sulle piastre di PANDIN nel mezzo di hPSC (Vedi punto 2.2), mantenere hPSCs a 37 ° C con 5% CO2. Aggiorna hPSC medio giornaliero (Vedi punto 2.3), eccetto il giorno dopo lo scongelamento o passaggio ed esaminare le cellule sotto il microscopio (obiettivi: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10x / 0.25 Ph1) per osservare la crescita votare e identificare potenziali aree di differenziazione (Figura 3 , pannello di sinistra superiore Mostra esempio di differenziazione). Passage hPSCs ogni 3-4 giorni, o quando cultura raggiunge > 80% confluenza. Se meno di 5% di differenziazione di cellule espositivo, uso hPSC normale metodo di passaggio (Vedi punto 2.4), in caso contrario, utilizzare il metodo dolce (Vedi punto 2.5). Quando non è più necessario nella cultura, hPSCs possono essere congelati per la conservazione a lungo termine (Vedi punto 2.6). Disgelo hPSCs nel mezzo di hPSC Trasferire il volume richiesto di hPSC medio per provette sterili per il procedimento di scongelamento (9 mL/criogenico tubo) e la piastra di PANDIN preparata a ricevere le cellule scongelate. Integrare il mezzo in entrambi i tubi con 10 µM RI. Recuperare lo stoccaggio provette criogenia da LN2 deposito e posto direttamente in un bagno d’acqua (37 ° C). Quando solo una piccola resti di cristallo di ghiaccio, rimuovere dal bagno di acqua e trasferire il contenuto del tubo criogenico per il tubo per lo scongelamento di processo (volume totale da 10 mL). Centrifugare la provetta a 290 x g per 5 minuti a TA. Utilizzare una pipetta sierologica per rimuovere il PANDIN soluzione dai pozzetti della piastra PANDIN (Vedi punto 1.4) destinata a ricevere le cellule e aggiungere mezzo hPSC con 10 µM RI.Nota: (importante) non non aspirato soluzione PANDIN con un ago di aspirazione, o esso può ghiacciare e intasare linee della pompa a vuoto. Rimuovere il surnatante dalla provetta e risospendere le cellule in un mezzo di hPSC con 10 µM RI. Distribuire le cellule alla piastra di destinazione con rapporto di 1 tubo/pozzetto criogenico di 6WP. Incubare a 37 ° C con 5% CO2e non aggiornare medio per 1 giorni.Nota: Avvio cellule al 5% O2 può aumentare la sopravvivenza delle cellule. Aggiorna hPSC medio Riscaldare il volume necessario di hPSC mezzo in una provetta sterile a temperatura ambiente o in un bagno di acqua; 2 mL/pozzetto di 6WP è suggerito.Nota: (Facoltativo): con l’aggiunta di una quantità extra di hPSC medio, hPSCs può rimanere un giorno extra senza aggiornare; Tuttavia, non permettere che questo più di una volta a settimana. Aspirare il mezzo da pozzetti contenenti hPSCs e aggiungere il terreno fresco hPSC. Coltura l’hPSCs in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. HPSCs passaggio nel mezzo di hPSC Trasferire il volume richiesto di hPSC media provette sterili, per processo di passaggio e per la preparazione del piatto PANDIN ricevere cellule secondarie. Integrare il supporto per la targa di destinazione con 10 µM RI. Scaldare i tubi medi a RT o in bagno d’acqua.Nota: La preparazione e la manipolazione sarà diversa se utilizzando un materiale di rivestimento alternativo rispetto a uno elencato nella Tabella materiali. Utilizzare una pipetta sierologica per rimuovere il PANDIN soluzione dai pozzetti della piastra PANDIN (Vedi punto 1.4) destinata a ricevere le cellule e aggiungere mezzo hPSC con 10 µM RI.Nota: (importante) non non aspirare la soluzione di PANDIN con un’aspirazione dell’ago, come può solidificare e intasare linee della pompa a vuoto. Aspirare il mezzo da pozzi con hPSCs per essere attraversate, lavare le cellule due volte con 0,5 mM EDTA, quindi aggiungere 0,5 mM EDTA e incubare per 2-5 min a 37 ° C.Nota: 1 mL/pozzetto di 6WP è un volume sufficiente di EDTA per incubazione e lavaggio. Controllare i pozzi sotto il microscopio (obiettivi: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10x / 0.25 Ph1). Se le cellule stanno cominciando a staccare, aspirare a filo cellule usando hPSC medio libero e soluzione di EDTA.Nota: (importante) fare attenzione a non rimuovere hPSC intere colonie quando aspirando EDTA (non aspettare fino a quando colonie intere sono lo scollegamento). Non irrorare le cellule più di 5 volte come questo potrebbe ledere hPSCs e pluripotenza. Inoltre, non lasciate cellule riposare in hPSC medium con RI prima di vampate di calore celle da pozzi, come si può ri-aderiscono alla piastra. Basato su determinazione empirica (solitamente legate alla confluenza, dimensioni delle colonie e il tasso di crescita), transfer hPSCs a pozzetti della piastra destinazione utilizzando un scissione rapporto di 1:4-1:16 (cioè, 1 pozzetto dalla targa originale a 4 pozzi della destinazione piastra). Incubare a 37 ° C con 5% CO2e non aggiornare medio per 1 giorni.Nota: Scissione rapporti alti come 01:16-01:20 sono possibili evitare affollamento e migliorare l’aspetto delle colonie. HPSCs passaggio utilizzando il metodo di brezza (G-metodo) Trasferire il volume richiesto di hPSC media provette sterili, per il processo di passaging e per la preparazione del piatto PANDIN ricevere cellule secondarie. Integrare il supporto per piastra di destinazione con 10 µM RI. Caldi tubi medi a RT o in bagnomaria a 37 ° C. Pipetta sierologica di uso per rimuovere PANDIN soluzione da pozzetti della piastra PANDIN (Vedi punto 1.4) destinato a ricevere le cellule e aggiungere mezzo hPSC con 10 µM RI.Nota: (importante) non non aspirato PANDIN con un ago di aspirazione, o esso può ghiacciare e intasare linee della pompa a vuoto. Aspirare medio dai pozzetti con hPSCs per essere attraversate e lavare le celle utilizzando due volte 0,5 mM EDTA. Il secondo lavaggio, attendere 30 s prima aspirando EDTA, quindi aggiungere 1 mL di PBS e incubare per 4-9 min a 37 ° C. Durante l’attesa, preparare una provetta sterile con 4 mL di PBS.Nota: 1 mL/pozzetto di 6WP è sufficiente volume di EDTA per il lavaggio. Controllare i pozzi sotto il microscopio (obiettivi: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10x / 0.25 Ph1). Se le cellule stanno iniziando a staccare, attentamente tocca i lati della piastra per aiutare gratis colonie. Quando > 50% delle colonie sono liberi di galleggiamento, utilizzare una pipetta sierologica di 5 mL per colonie in 1 mL di PBS di trasferimento nella provetta contenente 4 mL di PBS (non triturare).Nota: (importante) poiché lo scopo è quello di ripulire hPSC cultura, controllo per determinare se differenziato le cellule rimangono collegati alla piastra. Inoltre, non è necessario di passaggio tutte le colonie in un bene tramite questo processo, quindi colonie che rimangono attaccati possono essere lasciati alle spalle. Attendere 5-10 min a RT per celle a stabilirsi nella provetta (non centrifugare). Aspirare il PBS dal tubo, facendo attenzione a non per rimuovere hPSCs depositato. Attentamente risospendere le cellule in medium hPSC (non triturare) e trasferire le cellule per la piastra di destinazione utilizzando un scissione rapporto di 1:4-1:16. Incubare a 37 ° C con 5% CO2e non aggiornare medio per 1 giorni. Congelare giù hPSCs A seconda della confluenza, utilizzare 1 bene di hPSCs, alle 2-3 giorni (massimi) nella cultura, per riempire 1-2 fiale di crioconservazione per deposito LN2. Alla fine del passaggio (punto 2.5), utilizzare 500 µ l o 1 mL di terreno di hPSC per trasferire le cellule da 1 bene di 6WP per 1 o 2 flaconcini di crioconservazione, rispettivamente (500 µ l/flaconcino). In ogni provetta, aggiungere 500 µ l di 2x congelamento medio contenente il mezzo di hPSC, 20 µM RI e 20% DMSO.Nota: (Facoltativo) cellule possono essere trasferite direttamente in 1x congelamento medio a 1 mL/flacone. Disporre le provette criogeniche in un contenitore criogenico (contenenti isopropanolo) pre-raffreddate a 4 ° C e immediatamente a-80 ° C. Il giorno successivo, è possibile trasferire i tubi criogenici in una tanica per2 LN per immagazzinaggio a lungo termine. 3. protocollo 2: 3D “Organoid” differenziazione Installazione di differenziazione con G-metodo modificato di passaggio di hPSCs Trasferire il volume richiesto di NMM per il numero di pozzetti di destinazione in una provetta sterile. Supplemento con 4 ng/mL FGF2 e 10 µM RI. Riscaldare il tubo medio a RT o in bagnomaria a 37 ° C.Nota: A seconda della confluenza dei pozzi origination, hPSCs sono concentrati durante la distribuzione alla piastra di destinazione in un 2:1 o 3:1 rapporto (cioè, 2 pozzi dal documento originale su 1 bene della piastra destinazione), con un volume finale di 2,5 mL/pozzetto di 6WP. Aspirare il mezzo da pozzetti contenenti hPSCs deve essere differenziato e lavare le celle utilizzando due volte 0,5 mM EDTA. Il secondo lavaggio, attendere 30 s prima aspirando EDTA, quindi aggiungere 1 mL di PBS e incubare per 4-9 min a 37 ° C. Durante l’attesa, preparare una provetta sterile con 4 mL di PBS.Nota: 1 mL/pozzetto di 6WP è sufficiente volume di EDTA per il lavaggio. (Importante) È preferibile utilizzare hPSCs che erano non più di 3 giorni nella cultura dopo l’ultimo passaggio e almeno 1-2 passaggi dopo lo scongelamento. Verifica pozzi sotto il microscopio (obiettivi: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10x / 0.25 Ph1). Se le cellule stanno iniziando a staccare, liberare le cellule picchiettando sui lati della piastra. Trasferire le cellule in una provetta contenente 4 mL di PBS con una pipetta da 5 mL.Nota: Vampate di calore (importante) luce e triturazione è consentito suddividere colonie e raccogliere le cellule sciolte, ma ignorare le celle che rimangono aderite alla piastra. Lasciare il tubo a sedere per 10 min a RT, per separazione di gravità. Facoltativamente, centrifugare le cellule leggermente (non superiore a 200 x g a RT, per 5 min) se necessario. Aspirato il PBS dal tubo, facendo attenzione a non per rimuovere hPSCs depositata, risospendere le cellule in NMM con 4 ng/mL FGF2 e 10 µM RI e quindi distribuire alla piastra rivestite con AA in un rapporto 2:1 o 3:1. Incubare a 37 ° C con 5% di CO2e non si aggiorna il mezzo per 3 giorni, a meno che richiesto (Vedi punto 3.2.1).Nota: (Facoltativo) per comodità di trasferimento di cellule, aggiungere una porzione di terreno di coltura per pozzetti della piastra destinazione prima della distribuzione e risospendere le cellule in un volume più piccolo. Inoltre, hPSCs può essere macchiato e contato per definire la densità delle cellule partenza esatta. Tuttavia, il volume finale della piastra di destinazione dovrebbe essere 2,5 mL/pozzetto di 6WP. Mantenere la differenziazione digalleggiante cultura a 37 ° C (5% CO2) Controllare le piastre ogni giorno per cambiamenti di colore medio, accumulo di cellule morte, aggregazione e aderenza a bene fondi. Optional: Indipendentemente dalla pianificazione cambiamento medio, aggiornare (compresi i primi 3 giorni di no rinfrescante) il mezzo se ha trasformato giallo e seguire istruzioni per media cambiamento/aggiornamento (punto 3.3). Se la maggioranza delle cellule appaiono morta, seguire le istruzioni per media cambiamento/aggiornamento con separazione di gravità (punto 3.4).Nota: Formazione di EBs e la crescita in aggregati di grandi cellule sono previsti, ma cellule e aggregati cellulari possono raggrupparsi in grandi masse non a causa di crescita individuale/proliferazione. Se questo è osservato, luce triturazione per spezzare le masse è ammissibile. Se le cellule cominciano a aderire alla superficie di AA-piastra, il restante contenuto dei pozzi di galleggiamento può essere trasferito direttamente a nuovi pozzi, o trasferito durante il processo di cambiamento/aggiornamento medio. Non tentare di trasferire le cellule che hanno aderito alla piastra. Il giorno 3, cambiare il mezzo a NMM con 4 ng/mL FGF2. Aggiornare il mezzo ogni altro giorno. Il giorno 7, cambiare il mezzo a NMM con 1 µM acido retinoico (RA), 100 ng/mL FGF8B e 4 ng/mL FGF2. Aggiornare il mezzo ogni altro giorno.Nota: (importante) RA è sensibile alla luce. Proteggere i RA cultura campioni dalla luce. Il giorno 14, cambiare il mezzo a NMM con 100 ng/mL FGF8B, FGF4 100 ng/mL e 20 ng/mL FGF2. Aggiornare il mezzo ogni altro giorno. Il giorno 17, cambiare il mezzo a NMM con 100 ng/mL FGF8B. Aggiornare il mezzo ogni altro giorno. Il giorno 21, cambiare il mezzo a NMM con 100 ng/mL cervello derivato Neurotrophic Factor (BDNF) e 10 ng/mL Glial derivato Neurotrophic Factor (GDNF). Aggiornare il mezzo ogni altro giorno. Il giorno 28, cambiare il mezzo a NMM con 100 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL Neurotrophic Factor 3 (NT3) e 25 mM KCl. Refresh il mezzo ogni altro giorno. Il giorno 35, raccogliere il organoids 3D per l’analisi. Mezzo di differenziazione del cambiamento/aggiornamento per cultura 3D Trasferire il volume richiesto di NMM con i componenti appropriati (Vedi passi 3.2.2-3.2.7 per pianificazione di componente) in una provetta sterile. Caldo a bagnomaria a 37 ° C. Suggerimento la piastra e agitare delicatamente fino a quando le cellule si depositano i bordi inferiori dei pozzi. Con attenzione rimuovere 2 mL di terreno vecchio utilizzando una pipetta sierologica, evitando la rimozione delle cellule, quindi aggiungere 2 mL di terreno nuovo. Incubare a 37 ° C con 5% CO2.Nota: (importante), alla fine volume dovrebbe essere 2,5 mL/pozzetto di 6WP. In caso di evaporazione, non rimuovere 2 mL di vecchi media come questo sarebbe ulteriormente seccare colture cellulari; al contrario, aggiungere medium extra. Mezzo di differenziazione del cambiamento/aggiornamento con separazione di gravità Trasferire il volume richiesto di NMM con i componenti appropriati in una provetta sterile. Caldo a bagnomaria a 37 ° C. Trasferire il contenuto dei pozzetti in una provetta sterile e lasciare il tubo a sedere per 10 min a RT, per separazione di gravità. Utilizzare una pipetta per rimuovere il vecchio mezzo dal tubo, facendo attenzione a non rimuovere si stabilirono le cellule, risospendere in NMM con componenti appropriati e quindi distribuire ai nuovi pozzi rivestite con AA. Incubare a 37 ° C con 5% CO2.Nota: (Facoltativo) per comodità, una porzione di terreno di coltura può essere aggiunto alla destinazione pozzi prima della distribuzione, con differenziazione delle cellule risospese in un volume più basso. Il volume di fine dovrebbe essere 2,5 mL/pozzetto di 6WP. 4. protocollo n. 3: Differenziazione 2D alternativa cultura Avviare e mantenere la cultura utilizzando la procedura secondo la sezione 3 per protocollo 3D attraverso il giorno 12 Seguire i passaggi 3.1-3.2.3 e cambiamento/aggiornamento medio secondo punti 3.3 e 3.4. Passare a e mantenere come cultura dello strato monomolecolare 2D Il giorno 13 di differenziazione, seguire le istruzioni per mezzo di cambiamento/aggiornamento con la separazione di gravità (punto 3.4), distribuire solo le cellule/aggregazioni da PLO/LAM rivestito piastra (Vedi punto 1.6) con un volume finale di 2,5 mL/bene di 6WP.Nota: Il supporto può essere completato con 10 µM RI durante la placcatura iniziale per aiutare l’aderenza e la sopravvivenza delle cellule. (Importante) È auspicabile per distribuire uniformemente le cellule nei pozzetti, per evitare di bassa densità o affollamento sulle piastre e passaggio (Vedi punto 4.4) come necessario. La dimensione preferita di PLO/LAM rivestito di piastre (cioè, 6WP, 12WP, ecc.) deve essere determinata empiricamente, basato sul tasso di proliferazione della linea cellulare e lo scopo per il prodotto. Istruzioni verranno darà volumi per 6WP e possono essere convertite da dimezzare per ogni raddoppio del pozzo numero (cioè, 2 mL/pozzetto per 6WP, 1ml/bene per 12WP, ecc.) Il giorno 14, cambiare il mezzo a NMM con 100 ng/mL FGF8B, FGF4 100 ng/mL e 20 ng/mL FGF2. Aggiornare il mezzo ogni altro giorno come descritto al punto 4.3. Il giorno 17, cambiare il mezzo a NMM con 100 ng/mL FGF8B. Aggiornare il mezzo ogni altro giorno come descritto al punto 4.3. Il giorno 21, cambiare il mezzo a NMM con 100 ng/mL BDNF e GDNF 10 ng/mL. Aggiornare il mezzo ogni altro giorno come descritto al punto 4.3. Il giorno 28, cambiare il mezzo a NMM con 100 ng/mL BDNF e GDNF 10 ng/mL, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL NT3 e 25 mM KCl. Aggiorna il mezzo ogni altro giorno come descritto al punto 4.3. Il giorno 35, raccogliere le cellule per l’analisi, o mantenere sullo stesso supporto come passo 4.2.5 per cultura estesa (limite potenziale non testato). Mezzo di differenziazione del cambiamento/aggiornamento per cultura 2D Trasferire il volume richiesto di NMM con componenti appropriati (Vedi passi 4.2.2-4.2.5 per pianificazione di componente) in una provetta sterile. Caldo a bagnomaria a 37 ° C. Aspirare il mezzo da pozzi, quindi aggiungere 2 mL di terreno nuovo. Incubare a 37 ° C con 5% CO2.Nota: (Opzionale) alla fine volume può essere tenuto a 2,5 mL/bene di 6WP, utilizzando una pipetta per rimuovere 2 mL di terreno vecchio e aggiungere 2 mL di terreno nuovo. Riservare una parte della vecchia medie i pozzi e impedendo le cellule dal contatto con l’aria, possono diminuire scossa alle cellule durante le fasi di cambiamento. Cultura di passaggio 2D differenziazione Trasferire il volume richiesto di NMM con i componenti appropriati (Vedi passi 4.2.2-4.2.5 per pianificazione di componente) provette sterili, per passaggio processo e, separatamente, per preparare PLO/LAM rivestite in lamiera per la ricezione di cellule secondarie. Integrare il supporto della piastra destinazione con 10 µM RI. Scaldare i tubi medi a RT, o in un bagno di acqua a 37 ° C. Per risparmiare sui componenti, è possibile utilizzare NMM solo per lavare le cellule durante il processo di passaging.Nota: (importante) se i prodotti verranno utilizzati nell’imaging del calcio esperimenti, garantire alle cellule di passaggio tra 2-6 giorni prima della fine della differenziazione. Aspirare il mezzo dai pozzi per essere attraversate. Aggiungere 300 µ l/pozzetto di agente di dissociazione tripsina-base (Vedi Tabella materiali), ricciolo piatto per coprire i pozzetti, quindi rimuovere immediatamente l’agente di dissociazione. Fate riposare per 2 min a RT la piastra, poi allentare le cellule toccando i lati della piastra. Aggiungere 600 inibitore della tripsina definito µ l/pozzetto (DTI) e trasferire le cellule in DTI in una provetta sterile 5 ml NMM. Centrifugare la provetta a 290 x g per 15 min a RT. aspirato il mezzo e aggiungere un altro 5 mL NMM al tubo. Centrifugare la provetta a 290 x g per 15 min a RT. aspirato il mezzo e risospendere le cellule in mezzo appropriato contenente RI. Distribuire le cellule sulla piastra PLO/LAM utilizzando un rapporto di suddivisione di 1:1-1:12, a seconda della confluenza iniziale, il tasso di proliferazione e dimensione differenziale in origine alla piastra di destinazione e mantenere a 37 ° C con 5% CO2.

Representative Results

Panoramica visiva di ridotta crescita fattore protocolli di differenziazione cerebellare 2D e 3DLa figura 1 Mostra la sequenza temporale generale per i protocolli di differenziazione cerebellare 2D e 3D, identificando i fattori estrinseci e tempo di placcatura. Lo stato di avanzamento tipico per hPSCs in fase di differenziazione cerebellare 3D è raffigurato in Figura 2: con linea hESC H01 a partire come colonie nella cultura senza alimentatore al giorno 0 (parte superiore sinistra della figura); in fase di formazione di EB da giorno 2 (metà superiore); crescere in grandi aggregati di cellule con lume apparente dopo induzione neurale con RA e FGF8 al giorno 14 (alto a destra); Formazione di aggregati di varia grandezza e forma al giorno 28 (in basso a sinistra); lo sviluppo nella complessità con strutture diverse di un unico aggregato indicato al giorno 28 (metà inferiore); e ha continuato i cambiamenti morfologici per le stesse strutture al giorno 35 (basso a destra). Lo stato di avanzamento tipico per hPSCs in fase di differenziazione cerebellare 2D è raffigurato in Figura 3: con hESC linea H01 come colonie nella cultura senza alimentatore al giorno 0 (parte superiore sinistra della figura, con il cerchio che indica la zona di cellule differenziate tra le hESC colonie) ; in fase di formazione di EB da giorno 2 (metà superiore); crescere in grandi aggregati di cellule con lume apparente dopo induzione neurale con RA e FGF8 al giorno 13 (alto a destra); proliferano come cellule aderenti dopo il placcaggio al giorno 14 (in basso a sinistra); e poi come un monostrato di cellule con morfologia più complesso/maturo al giorno 35 sotto alto ingrandimento (basso a destra) e basso (metà inferiore). Prodotti 3D presentano marcatori e strutture dei primi NeuroepitheliumFigura 2 (immagine in basso a sinistra) e Figura 4 Mostra l’eterogeneità della morfologia di aggregata 3D visto in tutta la coltura, a causa di variabili di crescita e/o tassi di maturazione, come pure la fusione stocastico o spezzarsi di aggregati. Nonostante l’eterogeneità, ogni differenziazione produce aggregati espositrici marcatori precoci neurali e neuronali, compreso il marcatore di granuli cerebellari ZIC1, come indicato da immunocitochimica (ICC) colorazione nella Figura 5. Ancora più importante, nella figura 5 e Figura 6 suggeriscono che una semplice cultura 3D, con fattori di crescita ridotti, è in grado di generare aggregati con strutture complesse relazionati allo sviluppo del cervello come il neuroepithelium precoce e labbro rombico. Prodotti 2D presentano segni cerebellari e attività neuronale funzionaleMentre 2D culture non possono riprodurre strutture 3D complesse, sono in grado di generare cellule che esibiscono marcatori precoci neurali e neuronali, tra cui indicatore delle cellule cerebellari del granello ZIC1, come indicato dalla ICC macchiatura nella Figura 7. Analisi dell’espressione genica tramite RT-PCR, come si vede nella Figura 8, supporta ICC colorazione risultati, anche se la presenza di marcatori precoci di cella granello ATOH1 è variabile tra esperimenti e linee. Formazione immagine del calcio è più facilmente gestibile nella cultura 2D. Come si vede in Figura 9, Supplemental Video 1e Video supplementare 2, cellule stimolate elettricamente mostrano gli afflussi di calcio che sono tipici di schemi di attivazione neuronale, suggerendo la generazione dei neuroni funzionali. Figura 1: Timeline di protocollo di differenziazione (a partire da giorno 0 di differenziazione). Linea continua caselle indicano quando fattori specifici vengono aggiunti al terreno di coltura, e linea tratteggiata caselle indicano piastra-rivestimento per modifica 2D opzionale. Per FGF2, la freccia in giù si riferisce a concentrazioni più basse (4 ng/mL), e la freccia si riferisce alle più alte concentrazioni (20 ng/mL). Questa figura è stata modificata da Holmes e Heine10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: campo chiaro rappresentante immagini del protocollo 3D. hESC colonie al d0, EBs D2, aggrega dopo induzione a d14, aggregati di diverse dimensioni e morfologia (numerati 1-5) a d28, un unico aggregato con caratteristiche uniche, identificabili (indicati con lettere un–c) a d28, e cambiamenti visibili nelle stesse caratteristiche a d35. Barra della scala = 100 µm. Questa figura è stata modificata da Holmes e Heine10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: campo chiaro rappresentante immagini del protocollo 2D. hESC colonie un d0, EBs D2, aggrega dopo induzione a d13, dopo il placcaggio aggregati a d14, dopo maturazione a d35, come si è visto a 5 x ingrandimento e 20 ingrandimenti. Il cerchio bianco nel pannello di sinistra superiore mostra l’area di cellule differenziate tra le colonie hESC. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: campo chiaro immagini di varie dimensioni e complessità a 3D cultura. Aggregati al giorno (A) 8 (hESC) e (B) d35 (hiPSCs). L’immagine di quest’ultima è composta di tre immagini separate per mostrare l’intero aggregato. Entrambi gli aggregati possono essere influenzati dalla fusione di più piccoli aggregati o perdita (rottura) delle strutture. Barra della scala = 200 µm. Questa figura è ripubblicata da Holmes e Heine10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: ICC immagini di prodotti 3D mostrano gli indicatori pertinenti e strutture. Ai cultura d35, 3D prodotti mostrano: PAX6 (verde) e TBR2 (rosso) dal lumen di neurale rosetta-come formazione (prima fila); DCX (verde) e NeuN (rosso) diffusione da zona ventricolare del bordo esterno (VZ)-come struttura (seconda fila); KIRREL2, un indicatore connesso con neuroepithelium cerebellare (terza fila, a sinistra); e cellule ZIC1 un marcatore associato con granuli cerebellari (terza riga, destra). L’esperimento è stato condotto più volte utilizzando quattro hPSC diverse linee: linea hESC H01 (n = 5) e hvs88 linee iPSC (n = 4), hvs60 (n = 3) e hvs51 (n = 1). Frecce puntano al labbro rombico (RL)-come struttura. Barra della scala = 100 µm. Questa figura è ripubblicata da Holmes e Heine10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: struttura del tipo di zona ventricolare su larga scala in 3D prodotto. Alla cultura d35, un aggregato hESC-derivato è positivo per PAX6 (verde) e TBR2 (rosso) comunemente associati con i primi neuroni trovati all’interno di zone ventricolare (VZs) e subventricular zone (SVZs), in vivo. (In alto) Un asterisco (*) contrassegna il lato apicale di una regione di VZ-come che corre lungo il bordo dell’aggregato, con tra parentesi che indica la profondità/divisione di VZ / SVZs. (al centro) Merged segnali mostrano sezioni sparse di PAX6 + / TBR2-cellule aumentando di dimensioni verso l’estremità destra superiore di VZ. (In basso) Immagine di ingrandimento superiore della sezione indicata da un rettangolo nel pannello centrale. Barra della scala = 100 µm. Questa figura è stata modificata da Holmes e Heine10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: immagini di ICC di prodotti 2D mostrano gli indicatori pertinenti. Al cultura d35, esposizione di prodotti 2D, da hESCs (riga superiore) e hiPSCs (riga inferiore), celle positive per: indicatore delle cellule del granello ZIC1 e migratori neuroni cerebellari marcatore TAG1 (colonna sinistra); e il marcatore neuronale neurofilament (NF) e TAG1 (colonna destra). Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: RT-PCR di prodotti 2D. analisi di espressione del mRNA della linea hESC H01 (riga superiore) e hiPSC linea hvs60 (riga inferiore) alla fine del 2D protocollo Mostra prodotti con elettroforesi del gel per: indicatore delle cellule del granello ZIC1, indicatore delle cellule del granello ATOH1, migratori neuroni cerebellari marker TAG1, Purkinje indicatore di cella calbindina (CALB), canale del calcio voltaggio-dipendenti CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), recettore di acido gamma – aminobutirrico (GABA) B 1 (G-Br1) e gene housekeeping EIF4G2). Figura 9: calcio imaging/analisi dei prodotti 2D. A cultura d35, hPSC prodotti di differenziazione sono stati registrati per 2 min al microscopio, dopo incubazione con tintura di fluor5. 30 s, le cellule sono state stimolate elettricamente per 10 s a 10 Hz. (A) immagini fisse Visualizza hESCs a 0 s (a sinistra) e dopo l’inizio della stimolazione elettrica a 30 s (a destra). Le frecce indicano la regione di interesse (ROI) per l’analisi di afflusso del calcio. Risultati analisi grafica (B) cambiamento di fluorescenza relativa rispetto al tempo per ROI (cambiare in fluorescenza = (F-F0) / f0, dove F0 = (∑F1-n) / n), con picchi di neurone-come che si verificano prima, durante e dopo stimolazione. Barra nera indica la lunghezza della stimolazione elettrica. Scala bar (bianco) = 50 µm. completo di registrazione per hESC (come si vede qui) e una linea di hiPSC (non illustrato) sono disponibili nei supplementari Video 1 e Video supplementari 2, rispettivamente. Le registrazioni sono in formato AVI, alla velocità di 4x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Supplementare Video 1: calcio imaging video del prodotto 2D da hESC linea H01. A cultura d35, tingono i prodotti di differenziazione dalla riga hESC H01 sono stati registrati per 2 min al microscopio, dopo incubazione con fluor5. 30 s, le cellule sono state stimolate elettricamente per 10 s a 10 Hz. le registrazioni sono state fatte a 2 fotogrammi/s e trasformati in AVI video a ~ 7 fps, producendo un video durata ~ 30 s, alla velocità di ~ 4 x. Per favore clicca qui per scaricare questo file. Supplementare Video 2: calcio imaging video del prodotto 2D da hiPSC linea hvs51. A cultura d35, prodotti di differenziazione da hiPSC linea hvs51 sono stati registrati per 2 min al microscopio, dopo incubazione con tintura di fluor5. 30 s, le cellule sono state stimolate elettricamente per 10 s a 10 Hz. le registrazioni sono state fatte a 2 fotogrammi/s e trasformati in AVI video a ~ 7 fps, producendo un video durata ~ 30 s, alla velocità di ~ 4 x. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Complessità e i costi sono fattori rilevanti per ricercatori sulle cellule staminali quando scegliendo o lo sviluppo di protocolli di differenziazione. Ciò è particolarmente vero in quanto è una questione aperta di quanto controllo esterno è necessaria per generare tipi di cella desiderata, o — porre in modo diverso — come hPSCs competenti sono a produrre il proprio ambiente di sviluppo, se lasciati a se stessi con sufficiente sostanze nutrienti. Introduzione di fattori estrinseci in vitro può produrre molto bene i prodotti cella desiderata, ma potrebbe anche interferire con la capacità inerente allo sviluppo intrinseco avrebbero esibito cellule in vivo. Tali considerazioni sono importanti, soprattutto se l’obiettivo è uso di iPSCs derivate dal paziente per la modellazione di malattia. Ampio uso di campitura e/o fattori di crescita potrebbe mascherare fenotipi di malattia. I protocolli dettagliati in questo rapporto seguono l’andamento degli studi precedenti per ridurre la complessità, costo e/o utilizzo di fattori estrinseci patterning8,9.

Basato su risultati riportati da Muguruma et al., nostro recente studio, sembra che è possibile raggiungere la differenziazione verso destini cerebellare senza sforzi concertati per riprodurre condizioni in vivo , come hanno fatto gli studi più iniziali 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. la parte intrigante è che i due studi usato diversi insiemi di fattori di crescita, suggerendo che né insieme era necessarie, anche se entrambi utilizzati FGF2. Abbiamo fatto gli esami aggiuntivi, dove sono stati selettivamente escluso dal protocollo FGFs e ha mostrato che le cellule erano in grado di generare gli stessi prodotti senza estrinseca FGFs10. Differenze tra i nostri studi sono state qualificate dal fatto che abbiamo usato hPSC diverse linee e i metodi di coltura, ha indotto la differenziazione neurale con RA e incluso componenti per supportare la sopravvivenza delle cellule del granello e maturazione (BDNF, GDNF, SAG e KCL)11 –14. Inoltre, è stato impiegato un metodo di avvio meno complesso, rispetto al Muguruma et al.. Il protocollo ha cominciato generando EBs uniforme di 96WPs, che li isolati fisicamente e chimicamente da altro. Il protocollo qui aveva tutti i PSC relativamente affollati insieme in 6WPs durante la formazione di EB, che ha permesso loro di interagire liberamente. Come questo può differenzialmente influenzato l’ambiente fisico e chimico di EBs e successive organoids (compresa la produzione intrinseca di composti di segnalazione) è sconosciuto e potrebbe essere esplorato. Inoltre, mentre ci mostrano l’espressione di geni associati con — e così suggestivo di — origine cerebellare, situato all’interno di strutture morfologicamente simili a quelli riportati da Muguruma et al., non possiamo escludere la generazione di un neurone-come strutture che sono di identità non-cerebellare. Gli studi futuri, utilizzando un grande pannello di anticorpi simili a quelli riportati da Muguruma et al. (cioè, ATOH1, CALB, ecc.) renderebbe tali assegnazioni e confronto tra prodotti di entrambi i protocolli, più conclusivi.

All’interno del protocollo 3D, è importante per cominciare e mantenere un numero sufficiente di cellule in coltura per assicurare un numero sufficiente di prodotti finiti per l’analisi. Data la significativa diminuzione presto nel protocollo, si consiglia di iniziare con più di 500 EBs/pozzetto durante i primi 3 giorni nella cultura (Figura 1). Questo non dovrebbe essere difficile da realizzare dato Colonia dimensioni per hPSCs nella cultura senza alimentatore, ma potrebbe non essere così facile per chi utilizza ancora metodi di alimentatore-dipendente. Dato il gran numero di celle, è importante da guardare per cambiamento di colore nel mezzo (che indica le variazioni del pH) e accumulo di cellule morte. Entrambi devono essere corretti per prevenire il collasso della cultura. Ci possono essere anche agglutinamento delle cellule e degli aggregati in strutture massicce. Anche se si potrebbero ancora aggregati che possono essere analizzati, quantità di prodotto sarà notevolmente ridotto, così li rompere in piccoli aggregati con delicata triturazione può essere utile. Tuttavia, evitare di inquietanti aggregati normali, che a loro volta possono crescere fino a grandi dimensioni (Figura 4). Se gli aggregati diventano troppo radi, si consiglia di combinare pozzi, in modo che gli aggregati non sono completamente isolati. Variabilità del prodotto (in numero, dimensioni e morfologia) è un problema ben noto nella coltura cellulare 3D, tra cui per tali protocolli a partire con passaggi formazione EB isolati, uniforme, suggerendo che una procedura di avvio meno complessa (ad esempio il protocollo descritto qui ) potrebbe essere più pratico8,15. Mentre questa eterogeneità è qualcosa che i ricercatori devono tenere a mente, in particolare durante l’analisi, il protocollo ha segnalato generato prodotti coerenti con quelli trovati in altri protocolli 3D8,9,15. Base alle dimensioni e morfologia, cadono all’interno della gamma di Rosetta neurale a organoid cerebrale, come descritto in una recente revisione di Kelava e Lancaster15, con la maggior parte la classificazione della sferoide di montaggio. Particolarmente degno di nota, sono indicativi di rosette neurale con lume, zone ventricolare (sub) e rombico-labbro come caratteristiche la presenza di strutture 3D (Figura 5 e Figura 6) come identificato da altri gruppi di8 , 15 , 16 , 17. dal momento che ogni esperimento produsse almeno una aggregazione con presunti VZ/SVZs e cerebellare-collegata marcatori (ZIC1, KIRREL2), quelli sono utili criteri per determinare il successo di una differenziazione 3D utilizzando il nostro protocollo, con RL-come funzionalità che fornisce ulteriore supporto. Estendere la lunghezza della cultura ultimi 35 giorni non è stato testato, ma potrebbe essere perseguito per determinare il limite massimo di crescita, complessità e maturità consentito da questa tecnica.

Il protocollo 2D utilizza la stessa formazione di EB non aderente e il processo di induzione neurale come il protocollo 3D e così le osservazioni di cui sopra si applicano anche. Una volta placcato, dovrebbe essere considerato un diverso insieme di considerazioni. L’EBs dovrebbe aderire in fretta per cellule di proliferare verso l’esterno sulla piastra. Se ci sono problemi con aderenza, aggiunta di RI (se non già utilizzato), ridotto volume di terreno, o possono essere applicate modifiche sperimentali nella concentrazione di PLO/LAM. È importante mantenere le cellule dalla crescita troppo denso o troppo radi (preferibilmente coltivati tra 20-80% confluency) nei pozzetti; monitoraggio quotidiano e tempestivo passaggio è importante, per evitare over-confluenza o galleggiante celle. A differenza del protocollo 3D, non dovrebbero esserci diminuzione significativa durante la coltura, anche se ci possono essere zone di scarsa crescita, o un rallentamento del tasso di proliferazione. Passaggio influisce sullo stato di maturazione delle cellule (ad esempio, rimuovere i processi delle cellule e reti sviluppate fra le cellule) e dovrebbe essere tenuto presente quando si avvicina punti dove le cellule verranno raccolti o analizzate in qualche modo. Ad esempio, per calcio imaging è molto importante per le cellule di passaggio tra 2-6 giorni prima dell’analisi. Passaggio troppo vicino alla analisi potrebbero significare le cellule non hanno avuto tempo per la connessione e/o matura e troppo lontano può provocare cellule sovraffollamento, rendendo difficile la formazione immagine. Sebbene esista variabilità fra gli esperimenti, i risultati sono coerenti con quelli segnalati in iniziale 2D protocolli cerebellare1,2. Analisi di espressione di macchiatura e gene ICC confermano la presenza di cellule positive per indicatore delle cellule del granello ZIC1, identificando anche gli indicatori connessi con altre identità neurale e cerebellare (Figura 7 e Figura 8). La formazione immagine del calcio, che coinvolge la stimolazione elettrica delle cellule incubate con tintura di fluor5, indicata attività neuronale funzionale (Figura 9, supplementare nella figura 1e supplementare nella figura 2), anche se non è confermato se questi erano cellule del granello. Si può sostenere che dando le cellule più tempo per maturare, estendendo la lunghezza della cultura ultimi 35 giorni, dovrebbe aumentare la quantità di attività neuronale funzionale. Questo potenziale potrebbe essere esplorato in futuro.

Oltre le linee di ricerca suggerito sopra, sarebbe di interesse determinare differenze di identità di prodotto (quantità e qualità) tra i protocolli di 2D e 3D. L’importanza di FGFs estrinseca non è stato testato nel protocollo 2D, e sarebbe utile sapere se la mancanza di struttura 3D dopo il placcaggio, e così le vie di segnalazione associate, renderebbe la 2D culture più o meno dipendente da quelli presto patterning composti. Ulteriori protocolli Stripped-Down (ad es., no RA, BDNF, SAG) sono ugualmente plausibile linee per ulteriori indagini. Infine, gli studi futuri possono beneficiare di nuovi strumenti di ricerca per meglio caratterizzare (e valutare l’efficienza di generazione) umani specifici sottotipi neuronali cerebellare.

Con i dato avvertimenti in mente, entrambi segnalati protocolli possono essere utilizzati per differenziazioni cerebellare, con prodotti adatti a scopi diversi. Possono servire come punti di partenza pratici per ricercatori che intraprendono studi pilota, test di vitalità delle linee cellulari per tali differenziazioni, o come un modello di base per altri tipi di differenziazione neurale mirato.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati a Gerbren Jacobs e Jurjen Broeke per loro assistenza di tecnico esperti, di Prisca Leferink per contribuire alla generazione e alla caratterizzazione delle due linee di controllo iPSC e Lisa Gasparotto per dimostrare le nostre procedure.

Materials

DMEM/F12+Glutamax Gibco 31331-028 glutamine fortified DMEM/F12
Neurobasal medium Gibco 21103-049 neural basic medium
N2 supplement  Gibco 17502-048
B27 supplement Gibco 17504001
Insulin Imgen PT468-B
L-glutamine Gibco 25030-024
Non-essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma P3932 aka Poly-Hema
Laminin Sigma L2020
E8 medium and supplement Gibco A1517001 hPSC medium and supplement
Penicillin/Streptomycin  Gibco 15140-122
Sodium Chloride Sigma S-5886
y-27632 (ROCK inhibitor) SelleckChem S1049-10mg
DMSO Sigma D-2650
Geltrex Gibco A1413302 hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)
0,5M EDTA Gibco 15575-020
0.2 um filter VWR 28145-77
1.5 mL Eppendorf tube VWR 525-0130
DMEM/F12  Gibco 21331-020
Ethanol VWR 83804360
Parafilm Sigma PM996 wrap for culture plates
cryotubes ThermoFisher 368632
TrypLE Gibco 12563-029 trypsin-based dissociation agent 
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Gibco R-007-100
FGF-2 Peprotech 100-18B
FGF-4 R&D Systems 100-31
FGF-8B Peprotech 100-25
Retinoic Acid Sigma R2625
Brain Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-02
Glial Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-10
Potassium Chloride Sigma P5405
Neurotrophic Factor 3 Peprotech 450-03
Smoothened Agonist (SAG) Cayman 11914 CAS 912545-86-9
Axiovert 40C microscope Zeiss Brightfield imaging microscope
Axiocam Zeiss Brightfield imaging – image aquisition
Eppendorf Centrifuge 5810 Eppendorf 521-0996 centrifuge for cell culture
PBS (gebufferde natrium oplossing) Braun Medical 3623140
5 ml Serological pipets VWR 612-4950
10 ml Serological pipets VWR 612-4951
6-wells culture plates VWR 734-2323
12-wells culture plates VWR 734-2324
hESCs WiCELL line H01
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References

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Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification. J. Vis. Exp. (130), e56888, doi:10.3791/56888 (2017).
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