オプションの 2 D 加工で合理化された 3 D 小脳分化プロトコル

1. 準備 注: すべてのステップ材料表を特定の項目を参照してください。 HPSC 文化の定義 500 mL hPSC 培地を準備します。注: 手順 2.1 2.6 メディアを使用します。 HPSC 中サプリメント一晩 (o/n) 4 ° C で融解します。中瓶から hPSC 基本培地中の 12.5 mL を削除し、追加サプリメント、2.5 mL (100 U/L を作る) 10 mL ボトルにペニシリン/ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)。 4 ° C で保存し、2 週間以内に使用します。注: hPSC メディアは、10 μ M ロック阻害剤 (RI) および 10 %dmso を追加することによって、細胞を凍結する使用ことがあります。 分化誘導培養用 1 L ニューラル保守メディア (NMM) の準備します。注: 手順 3.1 4.4 メディアを使用します。 ミックス グルタミン強化 DMEM/F12 とニューラル基本培地 (1:1) 1 L のボトル、(1 x) N2 サプリメントで、サプリメント、(1 x) B27 を補う、5 μ g/mL インスリン、1.5 mM 100 μ M 非必須アミノ酸 (NEAA)、L-グルタミン 100 10 μ M と U/L ペン/連鎖球菌、β-メルカプトエタノール。 4 ° C で媒体を保存し、3 週間以内に使用します。注: サプリメントを基礎培地の混合に追加する前に、ストック濃度に基づいて追加の部品の必要量を調整するための適切なボリュームを削除します。 HPSCs を継の 0.5 mM EDTA 作業溶液 500 mL を準備します。注: 手順 2.4 および 2.5 メディアを使用します。 フロー-フードの下で 50 mL のチューブに 500 mL 滅菌 PBS ボトルから 49 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を転送します。0.5 M の EDTA の 0.5 mL と塩化ナトリウム 0.9 g を 50 mL のチューブに追加します。ゆっくり溶解するミックス。 フィルター滅菌ソリューション 500 mL 滅菌 PBS ボトルに 0.22 μ m のフィルターおよび転送を使用します。常温 (RT) を格納します。 HPSC 文化の hPSC の培養皿を準備します。注: は、手順 2.1-2.6 のプレートを使用します。 HPSC 適切な付着性コーティング (PAAC) の実用的なソリューション x 50: PAAC o/n 4 ° C でのバイアルを解凍DMEM/f12 キーと転送と 1:1 の比率で PAAC を 1.5 mL チューブに 400 μ 因数として希釈します。50 x 作業ソリューション PAAC-80 ° C で保存します。注: (重要) PAAC は、RT で迅速に固化、その氷の上 (または 4 ° c) (DMEM、管、等) のすべてのコンポーネントが格納されている必要があります。 4 ° C で実用的なソリューション PAAC x 50 のチューブを解凍し、冷たい DMEM/f12 キーで 50 倍に希釈します。希釈 PAAC の 750 μ L/ウェルを 6WP に追加します。37 ° C で少なくとも 1 h 用プレートを孵化させなさいメモ: PAAC プレートは 4 ° C で 1 週間 1 時間の潜伏期間の後、プレートをラップすることによって保存可能性があります。使用する前に 37 ° C に暖かいプレート。 分化の付着防止 (AA) プレートを準備します。注: は、手順 3.1 4.1 のプレートを使用します。 5 mg/mL を作るポリ (メタクリル酸 2-ヒドロキシエチル) 95% (ポリ HEMA) 水溶液エタノール。明確な解決策が得られるまで、37 ° C で o/n を振る。室温ストア注: 0.22 μ m のフィルターを通してフィルタ リング不溶ポリ HEMA を削除できます。 培養プレートにポリ HEMA を追加、各ウェルの底をカバーします。37 ° C でプレートを 2 日間、インキュベートし、井戸の制服/液体コーティングの完全に蒸発できるようにプレートを確認します。AA 板をラップし、室温保存されている可能性があります。 ポリ-L-オルニチン/ラミニン (PLO/ラム) プレートを分化誘導培養の準備します。注: は、手順については 4.2 4.4 プレートを使用します。 コート 20 μ G/ml PLO 滅菌 PBS に溶解を使用して井戸の表面の面積。プレートの o/n 37 ° c. で孵化させなさいPLO を吸引、PBS で 3 回をすすいでください。注: PLO (オプション) Incubated 板がラップ、必要になるまで 4 ° C で保存します。 PLO コーティング井戸の表面積をコート、10 μ g/mL ラムを使用して滅菌 PBS に溶解しました。37 ° C で少なくとも 2 時間または o/n 4 ° C でインキュベートします。ラムを削除および洗浄井戸 PBS で 2 〜 3 倍、適切な媒体および/または細胞をすぐに追加。注: (省略可能) 削除ラム ソリューション 4 ° C で保存して再使用できる 2 回まで。(重要)乾く; ラム塗装面を許可しません。防ぐために、これはすぐに PBS または適切なメディアを追加します。   2. プロトコル 1: 無料のフィーダー hPSC 文化 注: hESCs 非営利組織から得られた (H01 をライン、材料表を参照)。三行による制御 (hvs51、60、および 88) (線維芽細胞が匿名、匿名のドナー由来と IRB 承認したがって免除) 3 つの健康な人間の患者線維芽細胞をリプログラミングによって生成された10, 17。 フィーダー フリー培養で hPSCs を維持します。 融解と hPSC 培地で PAAC プレートの上に hPSCs をめっきした後 (手順 2.2 を参照)、5% CO2と 37 ° C で hPSCs を維持します。HPSC 中毎日更新 (手順 2.3 を参照)、日除く融解または通過後と顕微鏡下で細胞を検査 (目標: 5 x/0.12 2.5x/0.06 10 x/0.25 Ph0 Ph1) 観察成長率し、分化 (図 3 の潜在的な領域を特定するには、上部左側のパネルは、分化の例を示します)。 HPSCs すべての 3-4 日の通路またはとき文化に達する > 80% 合流。かどうか細胞展示の分化、メソッドを通過使用通常 hPSC の 5% 未満 (を参照してくださいステップ 2.4)、穏やかな方法を使用して、それ以外の場合 (ステップ 2.5 を参照してください)。文化の必要のない長期保存 hPSCs が凍結される可能性があります (ステップ 2.6 参照)。 HPSC 中 hPSCs を解凍します。 解凍処理 (9 mL/低温管) の生殖不能の管に、解凍されたセルを受信する準備ができて PAAC プレートに hPSC 媒体の必要量を転送します。10 μ M RI で両方のチューブ内の媒体を補完します。 水浴 (37 ° C) に直接 LN2ストレージと場所から、cryotube を取得します。ときのみ小さな氷の結晶のまま、風呂の水から削除、解凍過程の管に極低温の管の内容を転送 (合計量 10 mL)。室温 5 分 290 x g でチューブを遠心分離します。 血清ピペットを使用して削除、PAAC PAAC プレートの井戸からソリューション (手順 1.4 参照) 細胞を受け取り、10 μ M RI hPSC 媒体を追加するもの。注: (重要) はない吸引吸引針やそれで PAAC ソリューション可能性がありますを固めるし、真空ポンプに線を詰まらせます。 チューブから上澄みを除去し、10 μ M RI と hPSC 培地で細胞を再懸濁します。1 低温チューブ/6WP の井戸の比率で行先プレートに細胞を配布します。5% CO2、37 ° C で、1 日中を更新しないでください。注: 5% O2セル始動と細胞生存率が増加します。 HPSC 媒体を更新します。 HPSC 中 RT の生殖不能の管または湯せん; に必要な量を温める6WP の 2 mL/よくお勧めします。注: (省略可能): hPSC 中の余分な量を追加すると、hPSCs が更新; することがなく特別な日に残ることができます。ただし、ことはできませんこの週に 1 回以上。 HPSCs を含む井戸から培地を吸引し、新鮮な hPSC メディアを追加します。 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで hPSCs の文化. HPSC 中通路 hPSCs HPSC 中の必要量を継プロセスと継代細胞を受信する PAAC プレートの準備のための生殖不能の管に転送します。10 μ M RI と行先プレートのための媒体を補足します。常温または水浴中管を暖めます。注: の準備と処理は 1 つよりも代替塗装材料を使用して材料の表に記載されている場合に異なります。 血清ピペットを使用して削除、PAAC PAAC プレートの井戸からソリューション (手順 1.4 参照) 細胞を受け取り、10 μ M RI hPSC 媒体を追加するもの。注: (重要) はない吸引吸引で PAAC ソリューション針、固めるし、真空ポンプに線を詰まらせることがあります。 継代する、二度と 0.5 ミリメートルの EDTA、細胞を洗浄し、0.5 mM EDTA を追加、37 ° C で 2-5 分間インキュベートする hPSCs と井戸から培地を吸引します。注: 6WP の 1 mL/井戸は EDTA の洗濯とインキュベーションの十分な量です。 顕微鏡の下の井戸を確認 (目標: 5 x/0.12 2.5x/0.06 10 x/0.25 Ph0 Ph1)。セルは、デタッチし始めている場合、は、EDTA 溶液とフラッシュ セル hPSC 媒体を使用して無料を吸い出しなさい。注: (重要) 世話を EDTA を吸引するときに全体の hPSC のコロニーを削除しないこと (全体のコロニーを切り離すまでは待機しない)。フラッシュしませんセル 5 回以上害を hPSCs と多能性に影響を与える可能性があります。また、細胞再プレートに準拠していることがありますので、井戸からセルをフラッシュする前に RI と hPSC 培地でスタンドを聞かせてはいけません。 分割比率 1:4-1 を使用して行先プレートのウェルに hPSCs を転送 (通常は合流、植民地、および成長率のサイズに関連) 経験的な決定に基づいて、: 16 (すなわち、1 よく元の板から先の 4 の井戸にプレート)。5% CO2、37 ° C で、1 日中を更新しないでください。注: 1:16-1:20、混雑を防止し、コロニーの外観を改善することが可能高の比で分割します。 穏やかな方法 (G メソッド) を使用して通路 hPSCs 生殖不能の管、passaging のプロセスと継代細胞を受信する PAAC プレートの準備のために hPSC 媒体の必要量を転送します。10 μ M RI と行先プレートのための媒体を補足します。暖かい中管、RT、37 ° C の水浴 PAAC プレートの井戸から削除 PAAC ソリューションに使用血清ピペット (手順 1.4 参照) 細胞を受け取り、10 μ M RI hPSC 媒体を追加するもので。注: (重要) 行う吸引 PAAC 吸引針やそれでない可能性がありますを固めるし、真空ポンプに線を詰まらせます。 継代するのに hPSCs の井戸から培地を吸引し、2 回 0.5 mM EDTA を用いた細胞を洗ってください。2 番目の洗浄、EDTA、吸引する前に待機 30 s に 1 mL の PBS を追加し、37 ° C で 4 9 分間インキュベート待っている間、4 ml の PBS の生殖不能の管を準備します。注: 6WP の 1 mL/ウェルは、EDTA の十分な量を洗浄です。 顕微鏡の下の井戸を確認 (目標: 5 x/0.12 2.5x/0.06 10 x/0.25 Ph0 Ph1)。セルがデタッチする場合、慎重に無料コロニーのために板の側面をタップします。とき > 植民地の 50% が自由に動きます、4 mL の PBS を含む管に 1 mL の PBS に植民地を転送する 5 mL の血清ピペットを使用 (はないカップ刻んだ)。注: (重要) hPSC 文化をきれいにする目的であるので、セルのままを区別するかどうかを判断するチェックはプレートに取り付け。また、用いる井戸のこのプロセスは、接続されたまま植民地が残ることがありますのですべての植民地を通過する必要はありません。 チューブに定住する細胞のための RT で 5-10 分を待つ (遠心しない)。PBS を解決 hPSCs を削除しないように注意してチューブから吸引します。慎重に hPSC 培地で細胞を再懸濁します (はないカップ刻んだ)、し、セルを分割比率 1:4-1 を使用して行先プレートに転送: 16。5% CO2、37 ° C で、1 日中を更新しないでください。 HPSCs ダウン凍結します。 合流、によって LN2で貯蔵のための 1-2 凍結バイアルを記入する (最大) 文化では、2-3 日で hPSCs の 1 を使用します。 2.5 を継 (ステップ) の終わりには、500 μ L を使用してまたはそれぞれ 1 または 2 の凍結バイアルを転送する hPSC 培地 1 mL のセル 6WP の 1 から (500 μ L/バイアル)。各管に凍結中含まれている hPSC、20 μ M RI、および 20 %dmso × 2 の 500 μ L を追加します。注: (オプション) 細胞は、培地 1 mL/バイアル凍結 × 1 で直接転送できます。 4 ° C、-80 ° c. ですぐに店に事前冷却 (イソプロパノールを含む)、低温コンテナーでクライオ チューブを配置します。 次の日、長期保存用 LN2タンクに極低温の管を転送します。 3. プロトコル 2: 3 D」における「分化 HPSCs の継の変更された G による分化のセットアップ 生殖不能の管に先の井戸の数の NMM の必要量を転送します。Ng/mL FGF2 および 10 μ M RI 4 で補います。常温、または 37 ° C の水浴中管を温める注: オリジネーション井戸の合流によって hPSCs が集中して 2:1 または 3:1 の行先プレートへの配布中 2.5 mL/ウェルの最後の容積との比 (すなわち、行先プレートの 1 に元のプレートから 2 井戸)、6WP。 区別されるべき hPSCs を含む井戸から培地を吸引し、2 回 0.5 mM EDTA を用いた細胞を洗ってください。2 番目の洗浄、EDTA、吸引する前に待機 30 s に 1 mL の PBS を追加し、37 ° C で 4 9 分間インキュベート待っている間、4 ml の PBS の生殖不能の管を準備します。注: 6WP の 1 mL/ウェルは、EDTA の十分な量を洗浄です。(重要)解凍後最後の一節と、少なくとも 1-2 通路後 3 日間の培養よりももはやだった hPSCs を使用することをお勧めします。 顕微鏡下で井戸を確認 (目標: 5 x/0.12 2.5x/0.06 10 x/0.25 Ph0 Ph1)。セルは、デタッチし始めている、プレートの両側に穏やかな軽くたたくことによって細胞を無料します。管内 5 mL ピペットで 4 mL の PBS のセルに転送します。注: (重要) 光フラッシュおよび製粉許可する植民地分割が、バラセルを収集、プレートに付着のままセルを無視します。 重力分離のため常温では、10 分間座っている管を許可します。必要に応じて、セルを軽く遠心 (ない 5 分の常温では、200 x g 以上) 必要な場合。 解決 hPSCs を削除しないように注意してチューブから吸引 PBS 4 ng/mL で NMM で細胞を再懸濁します FGF2 と 10 μ M RI 後 2:1 または 3:1 の比率で AA コーティング プレートに配布。5% CO2、37 ° C で、必要でない限りは、3 日間、培地を更新しない (3.2.1 の手順を参照してください)。注: (オプション) セルを転送の利便性、分布、前に行先プレートの井戸に培地の部分を追加しより小さいボリュームで細胞を再懸濁します。また、hPSCs を染色、正確な開始セル密度を定義するカウント可能性があります。ただし、行先プレートの最終的なボリュームは、6WP の 2.5 mL/井戸をする必要があります。 37 ° c (5% CO2) 浮遊分化を維持します。 プレート中の色、死んだ細胞、クランプ、よく底に付着・蓄積の変化を毎日確認してください。 オプション: 中型の変更スケジュールに関係なく更新 (リフレッシュなしの最初の 3 日間) を含む培地になっている場合、黄色し、媒体変更/更新 (ステップ 3.3) の指示に従ってください。細胞の大半が死んだ場合、比重分離法 (ステップ 3.4) と媒体変更/更新の指示に従います。EBs の形成と大細胞凝集体への成長が期待されるメモ: しかし、セルとセルの集計することができます個々 の成長・増殖によらない大量に一緒に群生します。これは観察は、大衆を分割する光の製粉は許容です。セル開始 AA 板表面に付着する場合残りの井戸の内容を浮動新しい井戸に直接転送または媒体の変更/更新の処理中に転送されます。プレートを遵守してセルを転送しないでください。 3 日目、4 ng/ml FGF2 NMM に媒体を変更します。媒体の他の毎日を更新します。 7 日に媒体を変更 NMM 1 μ m 4 ng/mL FGF2、100 ng/mL FGF8B、レチノイン酸 (RA)。媒体の他の毎日を更新します。注: (重要) RA は光に敏感な。RA 文化サンプルを光から保護します。 14 日に 100 ng/mL FGF8B、100 ng/mL、FGF4 20 ng/mL FGF2 と NMM に媒体を変更します。媒体の他の毎日を更新します。 17 日には、100 ng/ml の FGF8B 媒体を NMM に変更します。媒体の他の毎日を更新します。 21 日に媒体を 100 ng/ml の脳由来神経栄養因子 (BDNF) NMM と 10 ng/mL グリア由来神経栄養因子 (GDNF) に変更します。媒体の他の毎日を更新します。 28 日に 100 ng/mL BDNF と 10 ng/mL 3 ng/mL サグ、100 ng/mL 神経栄養因子 3 (NT3) と 25 mM KCl. リフレッシュ中他毎日 GDNF NMM に媒体を変更します。 35 日、分析のための 3 D オルガノイドを収集します。 変更/更新 3次元培養用分化培地 (コンポーネントのスケジュールの手順 3.2.2-3.2.7 を参照)、適切なコンポーネントと NMM の必要量を生殖不能の管に転送します。37 ° C の水浴中で暖かい ヒント: プレートとセルが井戸の底の端に解決まで軽く振る。慎重に、細胞の除去を回避、血清ピペットを使用して古い培地 2 mL を削除し、新鮮な培地 2 mL を追加します。5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。注: 終わり (重要) ボリュームは 2.5 mL/6WP の井戸をする必要があります。蒸発が発生した場合は昔の媒体だろう乾燥細胞培養; さらに 2 mL を削除しないでください。その代わりに、余分なメディアを追加します。 変更/更新重力分離と分化培地 適切なコンポーネントと NMM の必要量を生殖不能の管に転送します。37 ° C の水浴中で暖かい 生殖不能の管に井戸の内容を転送でき、重力分離のため常温では、10 分間座っている管。 ピペットを使用してチューブから古いメディアを削除する、世話を削除しないこと、細胞、適切なコンポーネントと NMM で再懸濁しますが落ち着いた、新しい AA コーティング井戸に配布。5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。注: (オプション)、先に利便性、培地の一部を追加可能性がありますは井戸分布を低いボリュームで再停止されるセルを差別化する前の。最後のボリュームは 2.5 mL/6WP の井戸をする必要があります。 4. プロトコル 3: 代替 2D 分化 開始し、12 日目を通して 3 D プロトコルのセクション 3 に従って手順を使用して、カルチャを維持 ステップ 3.1 3.2.3 と 3.3 と 3.4 の手順に従って変更/更新中に従ってください。 切り替えて、2次元単層培養として維持 分化の 13 日、重力分離 (ステップ 3.4) を変更/更新中の指示に従い、セル/集計 PLO/ラム コーティング プレートの配布のみ (手順 1.6 参照) 2.5 mL/6WP の最後の容積と。注: 媒体は、10 μ M RI と初期めっき密着性と細胞の生存を助けるために補うことができます。(重要)低密度または板、混雑を避けるために、必要に応じて (手順 4.4 参照) を通過する、井戸のセルを均等に分散することをお勧めします。PLO/ラム コーティング プレート(すなわち6WP、12WP 等)の推奨サイズ必要があります経験的に決まります、細胞株の増殖率と製品の目的に基づきます。命令は、6WP、ためボリュームを与えるし、よく数 (すなわち6WP、1 mL のmL/ウェル/12WP 等は、2) の各倍増のため半減、変換できます。 14 日に 100 ng/mL FGF8B、100 ng/mL、FGF4 20 ng/mL FGF2 と NMM に媒体を変更します。4.3 の手順に従って、他の毎日メディアを更新します。 17 日には、100 ng/ml の FGF8B 媒体を NMM に変更します。4.3 の手順に従って、他の毎日メディアを更新します。 21 日に 100 ng/ml の BDNF NMM に媒体および 10 ng/mL GDNF を変更します。4.3 の手順に従って、他の毎日メディアを更新します。 28 日に 100 ng/mL ・ BDNF と 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL サグ、100 ng/mL NT3 と 25 mM KCl. リフレッシュ中 4.3 の手順に従って、他の毎日 NMM に媒体を変更します。 35 日の分析のための細胞を収集または拡張文化 (潜在的な制限をテストしていません) のステップ 4.2.5 として同じ媒体で維持します。 変更/更新二次元文化の分化培地 (コンポーネントのスケジュールの手順 4.2.2-4.2.5 を参照)、適切なコンポーネントと NMM の必要量を生殖不能の管に転送します。37 ° C の水浴中で暖かい 井戸から培地を吸引し、2 mL の新しい媒体を追加します。5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。注: 2.5 mL/6WP、ピペットを使用して古い培地 2 mL を削除して、新鮮な培地 2 mL を追加するのも、(省略可能) 最後のボリュームを維持できます。昔の一部を取っておく井戸と空気の接触から防ぐ細胞中がステップの変更中にセルへのショックを軽減します。 通路 2 D 分化 プロセスを通過のための生殖不能の管に転送 (コンポーネントのスケジュールの手順 4.2.2-4.2.5 を参照)、適切なコンポーネントと NMM の必要量と、別に、PLO/ラムを準備する継代細胞を受信するためのプレートをコーティングします。10 μ M RI と行先プレートの中を補足します。常温、または 37 ° C の水浴中チューブを暖かくコンポーネントに保存、passaging プロセス中に細胞を洗浄するため単独で NMM を使用することが可能です。注: (重要) カルシウム イメージング製品を使用する場合は実験、通路細胞分化の終わりの前に 2-6 日間を確保します。 継代する井戸から培地を吸引します。トリプシンによる解離剤 300 μ L/ウェルを追加 (材料の表を参照)、旋回板井戸をカバーし、解離エージェントをすぐに削除します。 RT で 2 分間座っているプレートを許可し、プレートの側面をタップしてセルを緩めます。600 μ L/ウェル定義トリプシン ・ インヒビター (DTI) を追加し、5 ml の NMM の生殖不能の管に DTI のセルを転送します。 吸引した媒体で 15 分 290 x g でチューブを遠心分離し、別 5 mL NMM をチューブに追加します。 吸引した媒体で 15 分 290 x g でチューブを遠心し、RI を含む適切な培地で細胞を再懸濁します。 1:1 1 の分割比を用いた PLO/ラム プレート上のセルを配布: 12 初期合流、増殖率とサイズの行先プレートに起源の差に応じて 5% CO2と 37 ° C で維持。