פרוטוקול בידול אסטרוציטומה 3D יעיל בשינוי 2D אופציונלי
Summary
אנו מתארים מדיום פרוטוקול מוגדרים hPSCs, באמצעות בידול 3D פשוטה, צמצום גורמי גדילה, מסוגל לייצר תא אגרגטים במבנים neuroepithelial מוקדם וחיובי אסטרוציטומה הקשורים סמנים, כמו גם אפשרי נוסף שינוי 2D עבור המבדילים תאים כמו טפט ליצירת נוירונים פונקציונלי.
Abstract
להפחית את המורכבות ואת העלות של בידול פרוטוקולים חשוב לחוקרים. עניין זה מתאים עם חששות לגבי תופעות לא מכוונות אפשריות המתבנת החיצוניים גורמים עשוי להציג לתוך תאי גזע pluripotent אנושי (hPSC) מודלים של התפתחות המוח או פתופיזיולוגיה, כגון מיסוך פנוטיפ המחלה. כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים בידול אסטרוציטומה עבור hPSCs, נועד עם שיטת ההפעלה פשוטה, גורמים פחות המתבנת, פחות דרישות החומרים ממספר הפרוטוקולים הקודמים. לאחרונה פיתחנו לתרבות הליכים, המניבות לתרשים תלת-ממדי (3D) מוצרים בקנה אחד עם פרוטוקולים “תא צורב” מוח אחרים, כולל מורפולוגיות הרלוונטיים דוגמנות התפתחות המוח כגון אזור sub/חדרית -, ומעוינים מבנים דמויי-שפתיים. השני משתמש הליך חד שכבתי חסיד, 2גרפיקה דו-ממדית כדי התמיינות להשלים, אשר מוצג מסוגל לייצר נוירונים אסטרוציטומה פונקציונלי, כפי חיוביים עבור סמני אסטרוציטומה הקשורים מוצרים, התערוכה נוירון כמו סידן influxes. יחד, פרוטוקולים אלה מציעים מדענים מגוון של אפשרויות מתאים למטרות מחקריות שונות, כמו גם מודל בסיסי לבדיקת סוגים אחרים של differentiations עצבית יעילה.
Introduction
במבחנה פרוטוקולים עבור המבדילים hPSCs לכיוון שושלות אסטרוציטומה בתחילה פעלו על עקרון מחקה ויוו פיתוח אסטרוציטומה1,2,3,4. וככזה, נדרש רצף של גורמים הציג במועדים ספציפיים לנהוג המתבנת pro-אסטרוציטומה ועם בגרות. בין אלה היו ונ ט, עצם morphogenetic חלבונים (BMPs), ו פקטורי גדילה פיברובלסט (FGFs) עם תפקידים ידוע בתחום הפיתוח hindbrain אמצע היווצרות של מארגן isthmic5,6,7. כמובן, כל צעד נוסף, גורם פירושו עלייה מניפולציות עתירי עבודה, הוצאות גדול עבור החוקר, אז פיתוח מסוגל בהשגת תוצאות שוות יותר פשוט פרוטוקולים הוא עניין. בעיה מעשית זו משתלב יפה עם השאלה ההיפותטית, אם תאים דרושה כזה חזק, חיצוני שליטה שלהם פיתוח חוץ גופית בתוך.
עבור בידול אסטרוציטומה, פרוטוקול שפורסם בשנת 2015 התייחס בצורך של באמצעות מספר רב של גורמי גדילה באמצעות רק FGF2, FGF19 ואת גורם לתא-derived סטרומה 1 (SDF1) עבור תכנים למטרות8. מחקר זה גם נבדל פרוטוקולים אסטרוציטומה מוקדמת, באמצעות מערכת תרבות לתרשים תלת-ממדי. בנוסף לייצור תאים חיובית עבור סמני אסטרוציטומה, המוח “organoids” שנוצר על ידי הטכניקה שלהם הוצגו שהפגינו מורפולוגיה הרלוונטיים, זמין בתרבויות מסורתיות טפט 2D, כגון מבנים דמויי-שפתיים ומעוינים. למרות פחות מורכבות ויקרות ביחס גורמי גדילה, תכונות אחרות כגון היווצרות אחיד embryoid (EBs) וגופי תרבות ב 96-ובכן צלחות (96WPs), עשה את זה לפי התהליכים מורכבים במהלך שלבים התחלתיים. פרוטוקול תלת-ממד נוסף שפורסם באותה השנה, דיווח על בידול מוצלחת שושלות עצביים באמצעות טכניקות תרבות תא נפוצה וזולה9. למרות קבוצה זו חקר קליפתי ולא בידול אסטרוציטומה, יישום של התפיסה שלהם עבור בידול אסטרוציטומה יכול לא להיות מוזלים.
לאחרונה דיווחנו פרוטוקול בידול אסטרוציטומה תלת-ממד באמצעות מספר מצומצם של גורמים המתבנת (כלומר, FGF2, 4 ו- 8), כמו גם התקנה פשוטה על ידי שמירה על תאים ב- 6-ובכן צלחות (6WPs) בכל כדי למזער את דרישות בינוני10. כדי לסייע ייצור תאי גרגר, smoothened אגוניסט (סאג) שימש במהלך השלב הסופי ההבשלה. סאג היא אלטרנטיבה כימי פחות יקר סוניק הקיפוד (ששש), אשר היה בשימוש לפני כן אסטרוציטומה בפרוטוקולים, בשל תפקידה לקדם את הצמיחה של גרגר תא מבשרי (GCPs) אין ויוו1,2, 11,12,13. בידול מוצרי היו בקנה אחד עם אלה של פרוטוקולים תלת-ממדיים אחרים, כולל הנוכחות של סמנים אסטרוציטומה הקשורים הרלוונטיים מורפולוגית מבנים8,9. תוצאות כאלה לחזק את המסר קודמות זה מפורט חיקוי של ה- ויוו הסביבה לא יהיה צורך מורכבים 3D במבחנה בידול פרוטוקולים.
בנוסף לפרוטוקול תלת-ממד, דו ח זה מתאר פרוטוקול 2D, נועד עם אותה התארגנות מהירה, חומרים בסיסיים, ואת מספר מופחת של גורמי גדילה. הוא מסוגל לייצר תאים של תאי גזע עובריים (hESCs) או המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs), חיובית עבור סמני המשויך מוקדם עצבית, אסטרוציטומה, גרגר תא זהויות. בנוסף, הסידן הדמיה מצביעה על הנוכחות של נוירונים אנושיים פונקציונלי. היכולת לבחור בין פרוטוקולים, מוסיפה רמה של גמישות לחוקרים, עבור מי שמעוניין גם: (1) ביצירת תאים מסוים יקליד, התפתחות המוח האנושי (2) דוגמנות ומקושרת מבנים, (3) ניתוח באופן חד שכבתי מיטבי הגדרות (למשל, תיקון-קלאמפ הקלטות), או אינטראקציות תא-תא (4) בתרבויות מעורבות עצבית. הטבע שלהם נמוכים ופשוט עושה אותם נגישים לחוקרים חדש בתחום hPSC, או צריך הליכים hPSC בסיס שממנו ניתן לחקור יותר אפשרויות בידול.
Protocol
Representative Results
Discussion
המורכבות עלויות הגורמים הרלוונטיים עבור תא גזע חוקרים בעת בחירת או לפתח פרוטוקולים בידול בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. דבר זה נכון במיוחד כפי שהיא שאלה פתוחה של כמה שליטה חיצוני נדרש כדי ליצור סוגי התאים הרצוי, או — לדגמן את זה אחרת – כמה hPSCs המוסמכת לייצר סביבה התפתחותית משלהם, אם עזב אל עצמם עם מספיק חומרים מזינים. הקדמה של גורמים extrinsic במבחנה היטב יכולות להפיק מוצרים התא הרצוי, אך הם גם עלולה להפריע עם הקיבולות התפתחותי מהותי תאים שכישוריי ויוו. שיקולים כאלה הם חשובים, במיוחד אם המטרה היא שימוש iPSCs החולה-derived עבור מידול המחלה. שימוש נרחב המתבנת ו/או גורמי גדילה יכול להסוות מחלה פנוטיפים. הפרוטוקולים המפורטים בדוח זה להמשך המגמה של מחקרים קודמים כדי להפחית את המורכבות, עלות, ו/או השימוש המתבנת החיצוניים גורמים8,9.
בהתבסס על תוצאות שדווחו על-ידי. Muguruma et al., והלימוד האחרונה שלנו, נראה שאפשר להשיג בידול כלפי גורלם אסטרוציטומה ללא מאמצים למיגור להתרבות ויוו תנאים, כפי שעשו מחקרים מוקדמים יותר 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. החלק מסקרן הוא שמשתמשים המחקרים שני סטים שונים של גורמי גדילה, רומז כי אף קבוצה היו נחוצים, אם כי שניהם להשתמש FGF2. . הרצנו בדיקות נוספות, איפה FGFs היו באופן סלקטיבי נכללו הפרוטוקול, הראה כי התאים היו מסוגל לייצר את אותם מוצרים ללא FGFs חיצוני10… ההבדלים בין המחקרים שלנו היו מוסמכים על ידי העובדה כי אנחנו בשימוש קווים hPSC שונים ופעולות תרבות המושרה בידול עצביים עם RA, כולל רכיבים כדי לתמוך הישרדות cell גרגר ועם בגרות (BDNF GDNF, סאג, אשלגן כלורי)11 –14. בנוסף, שיטת ההפעלה פחות מורכב, בהשוואה ל- Muguruma. et al., הועסק. פרוטוקול שלהם החלה על ידי יצירת EBs אחיד ב- 96WPs, אשר מבודדים אותם פיזית, כימית אחד מהשני. הפרוטוקול פה היה מגירסה יחסית צפוף יחד 6WPs במהלך היווצרות EB, אשר אפשרה להם לפעול בחופשיות. איך זה ייתכן באופן שונה השפיעו על סביבה הפיסיקליות והכימיות של EBs מאוחר יותר organoids (כולל ייצור מהותי של איתות תרכובות) אינה ידועה, יכולה להיחקר. בנוסף, בעוד אנו מציגים את הביטוי של גנים הקשורים — ו שבחבורה של — מקור אסטרוציטומה, ממוקם בתוך מבנים מורפולוגית דומים לאלה שדווחו על-ידי Muguruma. et al., אנחנו לא יכולים להוציא מהדור עצביים כמו מבני זה הן זהות שאינה אסטרוציטומה. מחקרים עתידיים, באמצעות פאנל גדול של נוגדנים כאלה שדווחו על-ידי. Muguruma et al. (כלומר, ATOH1, CALB, וכו) יעשה כזה הקצאות, השוואה בין מוצרים של פרוטוקולים, יותר חד משמעיות.
בתוך פרוטוקול 3D, זה חשוב כדי להתחיל עם, לשמור על מספר מספיק של תאים בתרבות כדי להבטיח מספר מספיק של מוצרי קצה לניתוח. בהתחשב die-off משמעותי מוקדם בפרוטוקול, מומלץ להתחיל עם יותר מ-500 EBs/טוב במהלך 3 הימים הראשונים בתרבות (איור 1). זה לא צריך להיות בקשיים להשיג המושבה נתון גדלים עבור hPSCs בתרבות נטולת מזין, אבל לא יכול להיות קל עבור אלה עדיין בשיטות תלויי-מזין. לאור המספר הגדול של תאים, חשוב לשמור על שינוי הצבע בינוני (המציין שינוי ה-pH), ואת הצטברות של תאים מתים. שניהם חייבים לתקן כדי למנוע התמוטטות של התרבות. יתכן שיש גם הצליעה של תאים, אגרגטים לתוך מבנים גדולים. למרות שזה עלול לגרום עדיין אגרגטים מסוגל לנתח, כמות המוצר תהיה פחותה בהרבה, כך נפרדים אותם לתוך אגרגטים קטנים יותר עם trituration עדין יכול להיות שימושי. אולם, להימנע מטרידה אגרגטים נורמלי, אשר עצמם יכולים לגדול במידות גדולות (איור 4). אם אגרגטים להיות דליל מדי, מומלץ לשלב בארות כך אגרגטים אינם מבודדים לגמרי. המוצר השתנות (ב מספר, גודל ומורפולוגיה) זו בעיה ידועה היטב בתרבות תא תלת-ממד, לרבות עבור פרוטוקולים אלה החל שלבי היווצרות EB מבודדת, אחיד, המציעה כי הליך הפעלה פחות מורכבים (כגון פרוטוקול המתוארים כאן ) יכול להיות יותר מעשי8,15. הטרוגניות זו אמנם משהו החוקרים צריכים לזכור, במיוחד במהלך ניתוח, פרוטוקול דיווח שנוצר מוצרים בקנה אחד עם אלה שנמצאו9,8,15אחרים פרוטוקולים 3D. בהתבסס על גודל, מורפולוגיה, הם נופלים בטווח של רוזט עצבית תא צורב המוח כפי שתואר בסקירה האחרונה על ידי Kelava ו לנקסטר15, עם הכי מתאים את הסיווג של ספרואיד. בולטים במיוחד, הן הנוכחות של מבנים תלת-ממד רמיזות של עצבי רוזטות עם לומן, אזורי חדרית (sub) ומעוינים-lip כמו תכונות (איור 5 ו איור 6) כפי שזוהו על ידי קבוצות השני8 , 15 , 16 , 17. מאז בכל ניסוי המיוצר לפחות אחד צבירה עם VZ בשם/SVZs אסטרוציטומה הקשורים סמנים (ZIC1, KIRREL2), אלו קריטריונים שימושי לקביעת ההצלחה של הבחנה תלת-ממד באמצעות הפרוטוקול שלנו עם דמוי-RL כולל מתן תמיכה נוספת. להאריך את משך תרבות העבר 35 ימים לא נבחנה, אבל יכול להיות נרדף לקבוע את גודל מרבי של צמיחה, מורכבות ובגרות מורשה על-ידי טכניקה זו.
פרוטוקול 2D משתמש באותה צורה EB שאינם מחסידי ותהליך אינדוקציה עצביות כמו פרוטוקול תלת-ממד, אז חלים גם דבריו לעיל. ברגע מצופה, קבוצה שונה של שיקולים שיש לשקול. EBs צריך לדבוק במהירות עבור תאים להתרבות החוצה לצלחת. אם יש בעיות עם הדבקות, תוספת של RI (אם כבר לא בשימוש), צמצום נפח בינוני, או ניתן להחיל שינויים ניסיוני בריכוז אש ף/לאם. זה חשוב לשמור תאים לגדול מדי צפוף או דלילים (רצוי בוגר בין 20-80% confluency) ב הבארות; פיקוח יומי, בזמן passaging חשוב להימנע תאים מעל-confluency או צף. בניגוד פרוטוקול תלת-ממד, לא אמור die-off משמעותית במהלך תרבות, אם כי ייתכנו אזורים של צמיחה המסכן, או על האטה של התפשטות המחירים. Passaging משפיע על המדינה ההבשלה של תאי (לדוגמה, הסרת התא תהליכי ורשתות המפותח בין תאים), יש לשמור בראש כשאתם מתקרבים נקודות איפה שנאסף או ניתח בצורה כלשהי תאים. לדוגמה, עבור סידן הדמיה זה חשוב מאוד לתאים המעבר בין 2-6 ימים לפני הניתוח. Passaging קרוב ניתוח המשמעות של תאים לא הספיקו כדי לחבר ו/או בוגר, רחוק מדי עלולה לגרום בתאים צפיפות יתר, מקשה על הדמיה. למרות השתנות בין ניסויים יכול להתקיים, התוצאות הן עקביות ביחס לאלה דיווח ראשוני פרוטוקולים אסטרוציטומה 2D1,2. ICC מכתים ג’ין ביטוי וניתוח לאמת את נוכחותם של תאים חיוביים עבור סמן תא גרגר ZIC1, בזמן גם זיהוי סמנים המשויך זהויות עצבית, אסטרוציטומה אחרות (איור 7 , איור 8). הדמיית סידן, אשר מערבת גירוי חשמלי של תאים מודגרות עם צבע fluor5, ציינו פונקציונלי פעילות. עצבית (איור 9 משלימה איור 1, משלימה איור 2), למרות שזה לא נכון אם אלה היו תאים גרגר. לנתיחה על ידי מתן התאים יותר זמן להבשיל על-ידי הרחבת האורך של תרבות העבר 35 ימים, מידת פעילות. עצבית תפקודית צריך להגדיל את זה פוטנציאל זה יכול להיחקר בעתיד.
בנוסף השורות של מחקר שהוצעו לעיל, זה יהיה עניין לקבוע הבדלים זהויות המוצר (בכמות ובאיכות) בין הפרוטוקולים 2D and 3D. חשיבותה של FGFs החיצוניים לא נבדקה בפרוטוקול 2D, וזה יהיה שימושי לדעת אם חוסר במבנה התלת-ממדי לאחר ציפוי, אז משויך איתות המסלולים, יגרום תרבויות 2D פחות או יותר תלוי אלה מוקדם תכנים תרכובות. פרוטוקולים בפרשן יותר (למשל, לא רה, BDNF, סאג) הם באותה מידה סביר קוי לחקירה נוספת. בסופו של דבר, מחקרים עתידיים עשויים להפיק תועלת כלי מחקר חדש כדאי לאפיין (והערכת יעילות הדור) יחוברו עצביים אסטרוציטומה אדם ספציפי.
עם ההליכים נתון בראש, שניהם דיווח פרוטוקולים עשוי לשמש differentiations אסטרוציטומה, עם מוצרים המותאמים למטרות שונות. הם עשויים לשמש נקודות המוצא מעשי לחוקרים מחקרים פיילוט, בדיקות הכדאיות של שורות תאים כאלה differentiations, או כמודל בסיסי עבור סוגים אחרים של בידול עצבית יישוב.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה ג’ייקובס Gerbren, Jurjen Broeke לקבלת סיוע טכני מומחה שלהם, כדי Prisca Leferink עבור תרומה של דור ואפיון של שתי שורות iPSC שליטה, וכדי ליסה Gasparotto הממחיש את הנהלים שלנו
Materials
| DMEM/F12+Glutamax | Gibco | 31331-028 | glutamine fortified DMEM/F12 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | neural basic medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504001 | |
| Insulin | Imgen | PT468-B | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma | P3932 | aka Poly-Hema |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| E8 medium and supplement | Gibco | A1517001 | hPSC medium and supplement |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| y-27632 (ROCK inhibitor) | SelleckChem | S1049-10mg | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | hPSC-appropriate adherent coating (PAAC) |
| 0,5M EDTA | Gibco | 15575-020 | |
| 0.2 um filter | VWR | 28145-77 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | VWR | 525-0130 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331-020 | |
| Ethanol | VWR | 83804360 | |
| Parafilm | Sigma | PM996 | wrap for culture plates |
| cryotubes | ThermoFisher | 368632 | |
| TrypLE | Gibco | 12563-029 | trypsin-based dissociation agent |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R-007-100 | |
| FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
| FGF-4 | R&D Systems | 100-31 | |
| FGF-8B | Peprotech | 100-25 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-02 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
| Neurotrophic Factor 3 | Peprotech | 450-03 | |
| Smoothened Agonist (SAG) | Cayman | 11914 | CAS 912545-86-9 |
| Axiovert 40C microscope | Zeiss | Brightfield imaging microscope | |
| Axiocam | Zeiss | Brightfield imaging – image aquisition | |
| Eppendorf Centrifuge 5810 | Eppendorf | 521-0996 | centrifuge for cell culture |
| PBS (gebufferde natrium oplossing) | Braun Medical | 3623140 | |
| 5 ml Serological pipets | VWR | 612-4950 | |
| 10 ml Serological pipets | VWR | 612-4951 | |
| 6-wells culture plates | VWR | 734-2323 | |
| 12-wells culture plates | VWR | 734-2324 | |
| hESCs | WiCELL | line H01 |
References
- Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).
- Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2012).
- Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells. Dev Biol. 290, 287-296 (2006).
- Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).
- Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain–hindbrain development. Trends Genet. 12, 15-20 (1996).
- Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).
- Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. Fetal and Neonatal Physiology. , (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Rep. 10, 537-550 (2015).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12, 671-678 (2015).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6, 402-406 (2017).
- Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).
- Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129, 1435-1442 (2002).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).
- Englund, C., et al. Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J Neurosci. 25, 247-251 (2005).
- Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, 782-789 (2011).
