Обтекаемый 3D мозжечковой дифференциация протокол с Факультативным 2D модификации
Summary
Мы опишем среднего определен протокол для hPSCs, с использованием упрощенных 3D дифференциации и снижение факторов роста, способны генерировать агрегаты клеток с раннего нейроэпителиальных структуры и позитивные мозжечковой связанные маркеры, а также необязательный 2D модификация для дифференциации клеток как однослойная для создания функциональных нейроны.
Abstract
Уменьшение сложности и стоимости дифференциации протоколов имеет важное значение для исследователей. Этот интерес подходит с опасения по поводу возможных непреднамеренных последствий что кучность внешние факторы могут ввести в человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) модели развития мозга или патофизиологии, например маскировки болезни фенотип. Здесь мы представляем два мозжечковой дифференциация протоколы для hPSCs, разработан с простой способ запуска, меньше патронирования факторов и меньше материальных требований, чем предыдущих протоколов. Недавно мы разработали процедуры культуры, которые генерируют свободные 3-мерной (3D) продуктов, согласуется с другими протоколами «органоид» мозга, включая морфологии отношение к моделированию развития мозга как sub/Вентрикулярная зона – и ромбических губы подобных структур. Второй использует сторонником, 2D монослоя процедуру полной дифференциации, которая показана способны генерировать функциональных нейроны мозжечка, как продукция являются позитивными для мозжечковой связанные маркеры и выставку нейроноподобных кальция притоков. Вместе эти протоколы предлагают ученых на выбор вариантов подходит для различных научно-исследовательских целей, а также базовой модели для тестирования других видов обтекаемый нейронных дифференцирования.
Introduction
В vitro протоколы для дифференциации hPSCs сторону мозжечковой линий первоначально действовали на принципе передразнивать в vivo мозжечковой развития1,2,3,4. Таким образом они требуют целого ряда факторов, представил в определенное время для про мозжечковая кучность и созревания. Главными среди них были WNT, костных морфогенетических белков (БМП) и факторы роста фибробластов (FGFs) с известных ролей в середине задний мозг развитие и формирование наружного Организатор5,6,7. Конечно каждый дополнительный шаг и фактор означает увеличение трудоемких манипуляции и больших расходов для исследователя, и поэтому разработка проще протоколы, способной на равных результатов представляет интерес. Этот практический вопрос хорошо согласуется с гипотетический вопрос, ли клетки требуют такой жесткой, внешний контроль над их развития в пробирке.
Мозжечковая дифференциации протокол, опубликованный в 2015 году выступил необходимость использования обширные количество факторов роста, используя только FGF2, FGF19 и стромальных клеток, полученных фактор 1 (SDF1) для структурирования цели8. Это исследование также отличается от предыдущих мозжечковой протоколов, с помощью системы свободного плавающего 3D культуры. Помимо производства позитивных клеток мозжечка маркеров, мозг «organoids» порожденных их техника были продемонстрированы выставить соответствующие морфологии, недоступны в традиционных 2D монослоя культур, таких как ромбические губ подобных структур. Хотя и менее сложным и дорогостоящим в отношении факторов роста, другие функции, такие как формирование единой embryoid органов (EBs) и культуры в 96-луночных пластины (96WPs), сделал это процедурно комплекс во время первоначальных шагов. Еще один 3D протокол опубликован в том же году, сообщает успешной дифференциации нейронных линий, с помощью общих и недорогой клеточной культуры техники9. Хотя эта группа изучает корковых вместо мозжечковой дифференциации, нельзя исключать применение их концепции мозжечковой дифференциации.
Недавно мы сообщили 3D мозжечковой дифференциация протокол, с помощью сокращения числа факторов патронирования (а именно, FGF2, 4 и 8), а также Упрощенная установка, сохраняя клетки в тарелки (6WPs) 6-хорошо во всем, чтобы свести к минимуму средних требований10. Чтобы помочь производства гранул клеток, сглаженную агонистов (SAG) был использован на этапе окончательного созревания. SAG является менее дорогим химические альтернативы Еж Соник (ТСС), который был использован в ранее мозжечковой протоколов, из-за его роль в содействии росту блок клеток прекурсоров (НКТ) в естественных условиях1,2, 11,12,13. Дифференциация продукции согласуются с теми, от других 3D протоколов, включая присутствие мозжечковой связанные маркеры в морфологически соответствующих структур8,9. Такие результаты укрепить ранее сообщение, что подробные мимикрия в естественных условиях окружающей среды не может быть необходимым для сложных 3D в vitro дифференциация протоколов.
В дополнение к 3D протокол, этот доклад описывает 2D протокол, разработанный с же быстрой установки, основные материалы и сокращено количество факторов роста. Он способен производить клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), положительный для маркеров, связанные с рано нейронные, мозжечка и блок ячеек самобытности. Кроме того кальций изображений указывает на присутствие функциональных человеческих нейронов. Возможность выбора между протоколами, добавляет уровень гибкости для исследователей, для тех, кто заинтересован в либо: (1) формирование определенных ячеек типов, (2) моделирование развития человеческого мозга и связанные структуры, (3) анализ оптимизированы в монослое Параметры (например, патч зажим записей), или (4) ячеек взаимодействий в смешанных нейронных культур. Их простой и недорогой природа делает их доступными для исследователей, которые являются новыми в hPSC поле, или нужна база hPSC процедуры из которого для дальнейшего изучения вариантов дифференцировки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сложность и затраты являются соответствующие факторы для исследователей стволовых клеток при выборе или разработке протоколов дифференциации. Это особенно верно, поскольку это открытый вопрос сколько внешнего контроля, необходимых для создания типов желаемого клеток, или — представляют по-разному — как компетентным hPSCs на производство их собственного развития окружающей среды, если оставить себе с достаточной питательные вещества. Введение внешние факторы в пробирке может очень хорошо продукцию нужной ячейки, но они могут также столкнуться с внутренней развития потенциала клеток будет выставлялись в естественных условиях. Эти соображения важны, особенно если целью является использование пациента производные iPSCs для моделирования заболевания. Широкое использование структурирования и/или факторов роста может маскировать болезни фенотипов. Протоколы, подробно изложены в настоящем докладе следуют тенденции предыдущих исследований для уменьшения сложности, стоимости и/или использования патронирования внешние факторы8,9.
Основываясь на результатах сообщили Мугурама et al. и наши собственные недавнее исследование, кажется, что это можно достичь дифференциации направлении мозжечковой судьбы без согласованных усилий, чтобы воспроизвести в vivo условия, как делали ранее исследования 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. интригующим часть является то, что два исследования разные наборы факторов роста, предполагая, что ни набор необходимы, хотя оба используется FGF2. Мы побежали дополнительные тесты, где FGFs выборочно исключены из протокола и показали, что клетки способны генерировать же продукты без внешняя FGFs10. Различия между нашими исследованиями были квалифицированы тот факт, что мы использовали различные hPSC линии и методы культуры, индуцированной нейронных дифференциации с РА и включены компоненты для поддержки выживание клетки гранул и созревания (BDNF, GDNF, SAG и KCL)11 –14. Кроме того было занято менее сложный способ запуска, по сравнению с Мугурама et al.. Их протокол начал путем создания единой EBs в 96WPs, который физически и химически изоляции их друг от друга. Протокол здесь были все УИК, относительно переполненных вместе в 6WPs во время формирования EB, что позволило им взаимодействовать свободно. Это может дифференциально влияние физических и химических окружающей среды EBs и позднее organoids (включая встроенные сигналы соединений) неизвестна и могут быть изучены. Кроме того, хотя мы показываем выражение генов связанные с — и поэтому наводящий — мозжечковой происхождения, расположен в пределах структуры, морфологически похожие на те, сообщает Мугурама et al., мы не можем исключать поколения нейронов подобных структур, которые являются не мозжечковая идентичности. Будущие исследования, используя большой группа антител как те сообщали Мугурама et al. (т.е., ATOH1, CALB, и т.д.) будет делать такие назначения и сравнение продуктов обоих протоколов, более убедительным.
В 3D протокол важно начать и поддерживать достаточное количество клеток в культуре для обеспечения достаточного числа конечных продуктов для анализа. Учитывая значительный падеж рано в протоколе, мы рекомендуем, начиная с более чем 500 EBs/хорошо в течение первых 3 дней в культуре (рис. 1). Это не должно быть трудно добиться данной колонии размеров для hPSCs в культуре фидер бесплатно, но может быть не так просто для тех, кто по-прежнему использовать фидер зависимые методы. Учитывая большое количество клеток, важно наблюдать за изменением цвета в средних (с указанием изменений рН) и накоплению мертвых клеток. Оба должны быть исправлены для предотвращения распада культуры. Там также может быть глыба ячеек и агрегатов в массивных конструкций. Хотя он все еще может привести к агрегаты, которые могут быть проанализированы, количество продукта значительно сократится, поэтому разбивая их на меньшие агрегатов с нежным Тритурация может быть полезным. Однако, следует избегать тревожной нормальных агрегатов, которые сами могут вырасти до больших размеров (рис. 4). Если агрегаты становятся слишком разреженный, рекомендуется сочетать скважин, так что агрегаты не полностью изолированы. Изменчивость продукта (в число, размер и морфология) является известной проблемой в 3D клеточной культуре, в том числе для этих протоколов, начиная с изолированной, единообразных шаги формирования EB, предполагая, что менее сложную процедуру запуска (например, протокол, описанные здесь ) может быть более практичным,8,15. Хотя эта разнородность является то, что исследователи должны иметь в виду, особенно во время анализа, сообщил протокол создают продукты в соответствии с теми, кто в других 3D протоколы по8,9,15. На основе размера и морфологии, они попадают в пределах нейронных розетка для церебральной органоид, как описано в недавнем обзоре Келава и Ланкастер15, с наиболее уместно классификации сфероида. Особенно заметно, присутствие трехмерных структур наводящий нейронных розеток с люмен, (суб) желудочка зон и ромбической губы как функции (рис. 5 и Рисунок 6) как определены другие группы8 , 15 , 16 , 17. Поскольку каждый эксперимент производится по крайней мере один совокупных с предполагаемым VZ/SVZs и мозжечковая связанные маркеры (ZIC1, KIRREL2), те являются полезными критерии для определения успеха 3D дифференциации, с помощью нашего протокола, с RL-как Особенности предоставления дополнительной поддержки. Увеличение продолжительности культуры последние 35 дней не был испытан, но могут применяться для определения максимальной степени роста, сложности и зрелости, допускаемых этой техники.
2D протокол использует же non сторонник EB формирования и нейронной индукции процесс 3D протокол и поэтому также применять комментарии выше. После того, как покрытие, следует рассмотреть другой набор соображений. EBs следует придерживаться быстро для клетки размножаться наружу на пластину. Если существуют проблемы с соблюдением, помимо ри (если уже не используется), сократить объем среднего, или экспериментальные изменения в ООП/Лам концентрации могут быть применены. Важно сохранить клетки от выращивания слишком плотной или разреженные (предпочтительно вырос между 20-80% confluency) в скважинах; Ежедневный мониторинг и своевременного пассированый важно избежать более confluency или плавающей клетки. В отличие от 3D протокол не должно быть значительных падеж во время культуры, хотя могут существовать области слабый рост, или замедление темпов распространения. Что влияет на состояние созревания клеток (например, удаление клеточных процессов и развитых сетей между клетками) и следует иметь в виду, когда приближается точек где клетки будут собраны или проанализированы в некотором роде. Например для кальция изображений это очень важно для прохода клетки между 2-6 дней до анализа. Пассированый слишком близко к анализ может означать клетки не имели времени для подключения и/или пожилые и слишком далеко может привести в клетках переполненности, затрудняя изображений. Хотя может существовать изменчивость между эксперименты, результаты согласуются с теми, кто в первоначальный 2D мозжечковой протоколы1,2. МТП окрашивание и гена анализ выражения подтверждают наличие клеток позитивные для гранул ячейке маркер ZIC1, а также выявление маркеров, связанные с другими нейронных и мозжечковая тождества (рис. 7 и рис. 8). Кальция изображений, которая включает в себя электрической стимуляции клеток с fluor5 красителя инкубирован, указали функциональную активность нейронов (Рисунок 9, дополнительная цифра 1и Дополнительные рисунок 2), хотя это не подтверждено если эти были блок клеток. Это утверждать, что, предоставляя клетки больше времени, чтобы созреть, расширяя длину культуры последние 35 дней, следует увеличить количество функциональной активности нейронов. Этот потенциал можно было бы изучить в будущем.
Помимо направления исследований, предложенных выше было бы интерес для определения различий в продукт тождества (количество и качество) между протоколами 2D и 3D. Важность внешние FGFs не был протестирован в протоколе 2D, и было бы полезно знать, если отсутствие 3D структуры после покрытия, и поэтому связанные сигнальных путей, сделает более или менее зависимыми от тех, кто рано кучность соединений 2D культур. Более урезанная протоколов (например, не РА, BDNF, SAG) одинаково правдоподобными линии для дальнейшего расследования. Наконец, будущие исследования могут воспользоваться новых исследовательских инструментов лучше характеризуют (и оценить эффективность поколения) мозжечковой нейрональных подтипы конкретного человека.
С данной оговорки в виду как сообщили, что протоколы могут быть использованы для верхней мозжечковой дифференцирования, с продуктами, подходит для различных целей. Они могут служить практических отправных точек для исследователей, проведение экспериментальных исследований, тестирования жизнеспособности линий для такого разграничения, или как базовая модель для других типов целевых нейронных дифференцировки клеток.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Gerbren Jacobs и Jurjen Broeke за их экспертную техническую помощь, чтобы Приска Leferink для содействия поколения и характеристика двух линий управления iPSC и Лиза Gasparotto для демонстрации наших процедур.
Materials
| DMEM/F12+Glutamax | Gibco | 31331-028 | glutamine fortified DMEM/F12 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | neural basic medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504001 | |
| Insulin | Imgen | PT468-B | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | |
| Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma | P3932 | aka Poly-Hema |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| E8 medium and supplement | Gibco | A1517001 | hPSC medium and supplement |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| y-27632 (ROCK inhibitor) | SelleckChem | S1049-10mg | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | hPSC-appropriate adherent coating (PAAC) |
| 0,5M EDTA | Gibco | 15575-020 | |
| 0.2 um filter | VWR | 28145-77 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | VWR | 525-0130 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331-020 | |
| Ethanol | VWR | 83804360 | |
| Parafilm | Sigma | PM996 | wrap for culture plates |
| cryotubes | ThermoFisher | 368632 | |
| TrypLE | Gibco | 12563-029 | trypsin-based dissociation agent |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R-007-100 | |
| FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
| FGF-4 | R&D Systems | 100-31 | |
| FGF-8B | Peprotech | 100-25 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-02 | |
| Glial Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | |
| Neurotrophic Factor 3 | Peprotech | 450-03 | |
| Smoothened Agonist (SAG) | Cayman | 11914 | CAS 912545-86-9 |
| Axiovert 40C microscope | Zeiss | Brightfield imaging microscope | |
| Axiocam | Zeiss | Brightfield imaging – image aquisition | |
| Eppendorf Centrifuge 5810 | Eppendorf | 521-0996 | centrifuge for cell culture |
| PBS (gebufferde natrium oplossing) | Braun Medical | 3623140 | |
| 5 ml Serological pipets | VWR | 612-4950 | |
| 10 ml Serological pipets | VWR | 612-4951 | |
| 6-wells culture plates | VWR | 734-2323 | |
| 12-wells culture plates | VWR | 734-2324 | |
| hESCs | WiCELL | line H01 |
References
- Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).
- Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2012).
- Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells. Dev Biol. 290, 287-296 (2006).
- Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).
- Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain–hindbrain development. Trends Genet. 12, 15-20 (1996).
- Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).
- Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. Fetal and Neonatal Physiology. , (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Rep. 10, 537-550 (2015).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12, 671-678 (2015).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6, 402-406 (2017).
- Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).
- Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129, 1435-1442 (2002).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).
- Englund, C., et al. Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J Neurosci. 25, 247-251 (2005).
- Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, 782-789 (2011).
