Gestroomlijnde 3D cerebellaire differentiatie Protocol met optionele 2D wijziging

1. voorbereiding Opmerking: Zie Tabel van materialen voor alle maatregelen voor bepaalde artikelen. 500 mL gedefinieerd hPSC kweekmedium voorbereiden hPSC cultuurOpmerking: Gebruik medium voor stappen 2.1-2.6. Ontdooien hPSC middellange supplement’s nachts (o/n) bij 4 ° C. Verwijderen van 12,5 mL hPSC basis voedingsbodem uit middelgrote fles, dan toevoegen van 10 mL supplement en 2,5 mL (waardoor 100 U/L) penicilline/streptomycine (Pen/Strep) op de fles. Bewaren bij 4 ° C en gebruik binnen 2 weken.Opmerking: Het hPSC medium kan worden gebruikt om te bevriezen van cellen door toevoeging van 10 µM ROCK remmer (RI) en 10% DMSO. 1 L neurale onderhoud medium (NMM) voorbereiden differentiatie cultuurOpmerking: Gebruik medium voor stappen 3.1-4.4. Mix-glutamine verrijkte DMEM/F12 en neurale voedingsbodem (1:1 verhouding) in een 1 L fles, dan supplement met (1 x) N2 supplement, (1 x) B27 aanvullen, 5 µg/mL insuline, 1.5 mM L-glutamine, 100 µM niet-essentiële aminozuren (NEAA), 100 U/L Pen/Strep, en 10 µM Bèta-mercaptoethanol. Opslaan van medium bij 4 ° C en binnen 3 weken gebruiken.Opmerking: Voordat u supplementen aan gemengde Basaal medium toevoegt, verwijdert het juiste volume aan te passen voor de vereiste hoeveelheid toegevoegde componenten op basis van voorraad concentraties. 500 mL van de werkoplossing voor 0,5 mM EDTA voorbereiden passaging hPSCsOpmerking: Gebruik medium voor stappen 2.4 en 2.5. Onder een stroom-motorkap, breng 49 mL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) uit een fles van 500 mL steriele PBS een tube van 50 mL. 0,5 mL van de EDTA 0.5M en 0.9 g NaCl toevoegen aan de tube van 50 mL. Mix zachtjes te ontbinden. Filter-steriliseren oplossing met behulp van een 0,22 µm filter en overdracht aan de steriele PBS-fles van 500 mL. Bewaren bij kamertemperatuur (RT). Voorbereiden hPSC cultuur platen hPSC cultuurOpmerking: Gebruik platen voor stappen 2.1-2.6. Maken 50 x werkoplossing van hPSC-geschikte aanhangend coating (PAAC): ontdooien van een flacon van PAAC o/n bij 4 ° C. Verdun PAAC in 1:1 verhouding met DMEM/F12 en overdracht als 400 µL aliquots in 1,5 mL buizen. Winkel 50 x werkoplossing PAAC bij-80 ° C.Opmerking: (belangrijk) PAAC snel stolt op RT, daarom is het noodzakelijk dat alle onderdelen (DMEM, buizen, enz.) op het ijs (of bij 4 ° C) worden gehouden. Ontdooien buis van 50 x werkoplossing PAAC bij 4 ° C, en vervolgens verdund 50 x in koude DMEM/F12. Voeg 750 µL per putje van verdunde PAAC aan een 6WP. Incubeer plaat voor ten minste 1 uur bij 37 ° C.Opmerking: PAAC platen kunnen worden opgeslagen voor 1 week bij 4 ° C, door inwikkeling van de plaat na 1 h incubatieperiode. Warme plaat tot 37 ° C vóór gebruik. Anti-lijm (AA) platen voorbereiden differentiatie cultuurOpmerking: Gebruik platen voor stappen 3.1-4.1. Maken van 5 mg/mL Poly (2-hydroxyethylmethacrylaat) (poly-HEMA) oplossing in 95% Ethanol. O/n schudden bij 37 ° C, totdat een duidelijke oplossing wordt verkregen. Winkel op RT.Opmerking: Filtering door een 0,22 µm filter onopgeloste poly-HEMA kunt verwijderen. Poly-HEMA aan de cultuur plaat toevoegen, zodat het betrekking heeft op de bodem van elke put. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 2 dagen en inspecteren van de plaat om ervoor te zorgen volledige verdamping van vloeistof/uniform coating van putten. AA platen kunnen worden verpakt en opgeslagen op RT. Poly-L-Ornithine/Laminin (PLO/LAM) platen voorbereiden differentiatie cultuurOpmerking: Gebruik platen voor stappen 4.2-4.4. Coat het oppervlak van putten, met behulp van 20 µg/mL PLO opgelost in steriele PBS. Incubeer de plaat o/n bij 37 ° C. PLO gecombineerd en spoel van 3 keer met PBS.Opmerking: (Optioneel) Incubated plaat met de PLO kan worden verpakt en opgeslagen bij 4 ° C totdat het nodig is. Jas van de oppervlakten van de PLO beklede putten, met behulp van 10 µg/mL LAM opgelost in steriele PBS. Incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 37 ° C of o/n bij 4 ° C. Verwijderen van LAM en wassen wells 2-3 x met PBS, dan Voeg onmiddellijk geschikte voedingsbodem en/of cellen.Opmerking: (Optioneel) verwijderd LAM oplossing kan worden opgeslagen bij 4 ° C en maximaal 2 keer opnieuw gebruikt. (Belangrijk) Laat niet LAM-gecoate oppervlakken te drogen; om te voorkomen dat dit onmiddellijk vergroten met PBS of geschikte voedingsbodem.   2. protocol 1: Feeder-vrije hPSC cultuur Opmerking: hESCs werden verkregen uit een niet-commerciële organisatie (lijn H01, Zie Tabel van materialen). Drie hiPSC control lijnen (hvs51, 60, en 88) werden gegenereerd door het herprogrammeren van fibroblasten van drie gezonde menselijke patiënten (fibroblasten waren afgeleid van anonieme, niet-identificeerbare donoren en daarom vrijgesteld van goedkeuring van de IRB)10, 17. HPSCs feeder-vrije cultuur handhaven Na het ontdooien en hPSCs op PAAC platen in hPSC medium plating (zie stap 2.2), hPSCs bij 37 ° C met 5% CO2handhaven. Vernieuwen hPSC medium dagelijks (zie stap 2.3), behalve de dag na ontdooien of passaging en cellen onder de Microscoop onderzoeken (doelstellingen: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1) te observeren de groei stem en identificeren van potentiële gebieden van differentiatie (Figuur 3 , upper linkerdeelvenster ziet u voorbeeld van differentiatie). Passage hPSCs elke 3-4 dagen, of wanneer cultuur bereikt > 80% samenvloeiing. Als minder dan 5% van de cellen tentoonstelling differentiatie, gebruik normale hPSC passaging methode (zie stap 2.4), de zachte methode anderszins te gebruiken (zie stap 2.5). Wanneer niet langer nodig in cultuur, hPSCs kunnen worden bevroren voor lange termijn opslag (zie stap 2.6). HPSCs in hPSC medium ontdooien Overdracht van de vereiste hoeveelheid hPSC medium steriele buizen voor het ontdooien proces (9 mL/cryogene buis) en aan de bereid PAAC plaat waarnaar ontdooide cellen. Een aanvulling op het medium in beide buisjes met 10 µM RI. Ophalen het cryotube LN2 opslag en plaats rechtstreeks in een waterbad (37 ° C). Wanneer slechts een klein ijs kristal blijft, verwijderen uit het waterbad en breng de inhoud van de cryogene buis aan de buis voor het ontdooien van proces (total volume 10 mL). Centrifugeer de buis bij 290 x g gedurende 5 min op RT. Gebruik een serologische pipet voor het verwijderen van de PAAC oplossing van de putjes van de plaat van PAAC (zie stap 1.4) bedoeld om te ontvangen van cellen en toevoegen van hPSC medium met 10 µM RI.Opmerking: (belangrijk) niet aspirate PAAC oplossing met een zuignap naald, of het kan stollen en lijnen naar de vacuüm pomp verstoppen. Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de buis en resuspendeer de cellen in hPSC medium met 10 µM RI. De cellen aan de plaat van de bestemming op de verhouding van 1 cryogene buis/put van 6WP verspreiden. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2, en niet vernieuwen medium voor 1 dag.Opmerking: Opstarten van cellen op 5% O2 overleving van de cel kan verhogen. Vernieuwen hPSC medium Warm de nodige hoeveelheid hPSC medium in een steriele buis op RT of in een waterbad; 2 mL/putje van 6WP wordt voorgesteld.Opmerking: (Optioneel): door toevoeging van een extra bedrag van hPSC medium, hPSCs kan blijven een extra dag zonder fris; echter niet toegestaan dit meer dan eenmaal per week. Gecombineerd het medium uit putten met hPSCs en verse hPSC medium toe te voegen. Cultuur van de hPSCs in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Passage hPSCs in hPSC medium De vereiste hoeveelheid hPSC medium overbrengen in steriele buizen, voor passaging proces en voor de bereiding van PAAC plaat te ontvangen gepasseerd cellen. Een aanvulling op het medium voor de bestemming plaat met 10 µM RI. Warm de middellange buizen op RT of in een waterbad.Opmerking: Voorbereiding en behandeling variëren als met behulp van een alternatieve coating materiaal dan vermeld in de Tabel van materialen. Gebruik een serologische pipet voor het verwijderen van de PAAC oplossing van de putjes van de plaat van PAAC (zie stap 1.4) bedoeld om te ontvangen van cellen en toevoegen van hPSC medium met 10 µM RI.Opmerking: (belangrijk) niet aspirate de PAAC oplossing met een zuigkracht naald, aangezien het kan stollen en lijnen naar de vacuüm pomp verstoppen. Het medium uit putten met hPSCs gecombineerd te worden gepasseerd, wassen van cellen tweemaal met 0,5 mM EDTA, dan toevoegen van 0.5 mM EDTA en incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C.Opmerking: 1 mL/putje van 6WP is een voldoende hoeveelheid van de EDTA voor wassen en incubatie. Controleren van de putten onder de Microscoop (doelstellingen: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Als cellen beginnen te ontkoppelen, gecombineerd EDTA-oplossing en gratis gebruik van hPSC medium flush cellen.Opmerking: (belangrijk) zorg niet te verwijderen van de hele hPSC kolonies wanneer zuigen EDTA (wacht niet tot hele kolonies zijn loskoppelen). Niet leeggemaakt cellen meer dan 5 keer als dit kan schade toebrengen aan hPSCs en pluripotent beïnvloeden. Ook laat geen cellen staan in hPSC medium met RI voordat blozen cellen uit putten, als ze opnieuw aan de plaat voldoen kunnen. HPSCs op basis van empirische bepaling (meestal gerelateerd aan de samenvloeiing, grootte van de kolonies en groeitempo op jaarbasis), overbrengen in putjes van de plaat van de bestemming met behulp van een splitsing verhouding van 1:4-1:16 (d.w.z., 1 goed van de oorspronkelijke plaat aan 4 putjes van de bestemming plaat). Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2, en niet vernieuwen medium voor 1 dag.Opmerking: Splitsen ratio’s zo hoog als 1:16-1:20 mogelijk zijn ter voorkoming verdringing en verbetering van de verschijning van kolonies. Passage hPSCs met behulp van de zacht-methode (G-methode) De vereiste hoeveelheid hPSC medium overbrengen in steriele buizen, voor het passaging proces en voor de bereiding van PAAC plaat te ontvangen gepasseerd cellen. Een aanvulling op het medium voor de bestemming plaat met 10 µM RI. Warme middellange buizen op RT of in waterbad bij 37 ° C. Gebruik serologische pipet te verwijderen PAAC oplossing van putjes van de plaat PAAC bedoeld (zie stap 1.4) om te ontvangen van de cellen en toevoegen hPSC medium met 10 µM RI.Opmerking: (belangrijk) niet aspirate PAAC met het een zuiging naald, of het kan stollen en lijnen naar de vacuüm pomp verstoppen. Gecombineerd worden overgedragen door de putjes met hPSCs om te worden gepasseerd, en wassen van de cellen tweemaal gebruik van 0.5 mM EDTA. Op de tweede wash, wachten 30 s voordat zuigen EDTA, vervolgens 1 mL PBS toe en incubeer gedurende 4-9 minuten bij 37 ° C. Terwijl we wachten, bereiden een steriele buis met 4 mL PBS.Opmerking: 1 mL/putje van 6WP is voldoende hoeveelheid EDTA voor wassen. Controleren van de putten onder Microscoop (doelstellingen: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Als cellen beginnen te ontkoppelen, tikt u zorgvuldig op de zijkanten van de plaat om te helpen de vrije kolonies. Wanneer > 50% van de kolonies zijn vrij zwevend, gebruik een serologische 5 mL-pipet kolonies in 1 mL PBS overbrengen naar de buis met 4 mL PBS (niet triturate).NOTITIE: (belangrijk) Aangezien het doel is om schoon te maken hPSC cultuur, controleren om te bepalen of gedifferentieerde cellen blijven gekoppeld aan de plaat. Ook is het niet nodig om de passage van alle kolonies in een goed gebruik van dit proces, dus kolonies die aangesloten blijven kunnen worden achtergelaten. Wacht 5-10 min op RT voor cellen zich te vestigen in de buis (doen niet centrifugeren). Gecombineerd PBS uit de buis, als u niet wilt verwijderen van de vaste hPSCs verzorgen. Zorgvuldig resuspendeer de cellen in hPSC medium (doen niet triturate), en de overdracht van de cellen aan de plaat van de bestemming met behulp van een splitsing verhouding van 1:4-1:16. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2, en niet vernieuwen medium voor 1 dag. Bevriezen naar beneden hPSCs Afhankelijk van de samenvloeiing, met 1 goed van hPSCs, op 2-3 dagen (maximaal) in cultuur, vullen van flacons van 1-2 cryopreservatie voor opslag in LN,2. Aan het einde van de passaging (stap 2.5), gebruik 500 µL of 1 mL van hPSC medium overbrengen cellen uit 1 goed van 6WP tot 1 of 2 cryopreservatie flesjes, respectievelijk (500 µL/injectieflacon). Voeg aan elke buis, 500 µL van 2 x bevriezing middellange met hPSC medium, 20 µM RI, en 20% DMSO.Opmerking: (Optioneel) cellen kunnen overgedragen worden direct in 1 x medium bij 1 mL/injectieflacon bevriezing. Plaats de cryogene buizen in een cryogene container (met isopropanol) vooraf gekoeld tot 4 ° C, en winkel onmiddellijk bij-80 ° C. Op de volgende dag, door de cryogene buizen te overbrengen in een tank2 LN voor langdurige opslag. 3. protocol 2: 3D “Organoid” differentiatie Opstelling van differentiatie met gemodificeerde G-methode van de passaging van hPSCs De vereiste hoeveelheid NMM voor het aantal bestemming wells overbrengen in een steriele buis. Aanvulling met 4 ng/mL FGF2 en 10 µM RI. Warm de medium buis op RT of in waterbad bij 37 ° C.Opmerking: Afhankelijk van de samenvloeiing van de putjes ontstaan, hPSCs zijn geconcentreerd tijdens de distributie naar de bestemming plaat in een 2:1 of 3:1 verhouding (dat wil zeggen, 2 putten van de oorspronkelijke plaat aan 1 goed van de bestemming-plaat), met een volume van de einde van 2.5 mL per putje van 6WP. Gecombineerd het medium uit putten met hPSCs te differentiëren en wassen van de cellen tweemaal gebruik van 0.5 mM EDTA. Op de tweede wash, wachten 30 s voordat zuigen EDTA, vervolgens 1 mL PBS toe en incubeer gedurende 4-9 minuten bij 37 ° C. Terwijl we wachten, bereiden een steriele buis met 4 mL PBS.Opmerking: 1 mL/putje van 6WP is voldoende hoeveelheid EDTA voor wassen. (Belangrijk) Het verdient de voorkeur te gebruiken hPSCs die langer dan 3 dagen in cultuur na de laatste passage, en ten minste 1-2 gangen na het ontdooien waren. Controleren van de putten onder de Microscoop (doelstellingen: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Als cellen beginnen om los te maken, gratis de cellen door zacht te onttrekken aan de zijkanten van de plaat. De cellen overbrengen in een buis met 4 mL PBS met een 5 mL-pipet.Opmerking: (belangrijk) licht spoelen en verpulvering is toegestaan om te breken van kolonies en verzamelen losse cellen, maar het negeren van cellen die gekleefd aan de plaat blijven. Het toestaan van de buis te zitten voor 10 min op RT, voor de scheiding van de zwaartekracht. Optioneel, centrifugeer de cellen licht (niet groter dan 200 x g bij RT, gedurende 5 minuten) indien nodig. Aspirate de PBS uit de buis, als u niet wilt verwijderen van de vaste hPSCs, verzorgen resuspendeer de cellen in NMM met 4 ng/mL FGF2 en 10 µM RI, en vervolgens distribueren naar de AA beklede plaat in een 2:1 of 3:1 verhouding. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2, en niet het medium vernieuwen voor 3 dagen, tenzij vereist (zie stap 3.2.1).Opmerking: (Optioneel) voor het gemak van de overdracht van cellen, een deel van het kweekmedium toevoegen aan putjes van de plaat van bestemming vóór verdeling en resuspendeer de cellen in een kleiner volume. Ook kan hPSCs worden gekleurd en geteld om te definiëren van de exacte begin celdichtheid. Het eindvolume in de bestemming plaat moet echter 2,5 mL/putje van 6WP. Handhaven van vrij zwevende differentiatie cultuur bij 37 ° C (5% CO2) Check de platen elke dag voor veranderingen in middelgrote kleur, opeenhoping van dode cellen, samendoen en aanhankelijkheid aan goed bodems. Optioneel: Ongeacht het medium wijziging schema, vernieuwen (met inbegrip van de eerste 3 dagen van no verfrissend) het medium als bleek heeft gele, en volg instructies voor middellange verandering/vernieuwen (stap 3.3). Als de meerderheid van de cellen dode weergegeven, volg de instructies voor middellange verandering/vernieuwen met zwaartekracht scheiding (stap 3.4).Opmerking: Vorming van EBs en groei in de grote cel aggregaten worden verwacht, maar cellen en cel aggregaten kunnen samen klomp in grote massa’s niet te wijten aan persoonlijke groei/proliferatie. Indien dit wordt waargenomen, is lichte verpulvering te breken van de massa’s toegestaan. Als cellen beginnen zich te houden aan het oppervlak van de AA-plaat, kan de resterende inhoud van putten drijvende worden rechtstreeks overgedragen naar nieuwe putten of overgedragen tijdens het proces van middellange verandering/vernieuwen. Probeer niet om over te brengen van cellen die aan de plaat hebben gehouden. Op dag 3, omzetten in het medium NMM met 4 ng/mL FGF2. Vernieuw het medium om de andere dag. Op dag 7, omzetten in het medium NMM met 1 µM Retinoic Acid (RA), 100 ng/mL FGF8B en 4 ng/mL FGF2. Vernieuw het medium om de andere dag.Opmerking: (belangrijk) RA is lichtgevoelig. RA cultuur monsters beschermen tegen licht. Op dag 14, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 en 20 ng/mL FGF2. Vernieuw het medium om de andere dag. Op dag 17, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL FGF8B. Vernieuw het medium om de andere dag. Op dag 21, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL hersenen afgeleide Neurotrophic Factor (BDNF) en 10 ng/mL gliale afgeleide Neurotrophic Factor (GDNF). Vernieuw het medium om de andere dag. Op dag 28, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL BDNF en 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL Neurotrophic Factor 3 (NT3) en 25 mM KCl. Refresh het medium om de andere dag. Op dag 35, verzamelen de 3D organoids voor analyse. Verandering/vernieuwen differentiatie medium voor 3D cultuur De vereiste hoeveelheid NMM met de geschikte onderdelen (Zie de stappen 3.2.2-3.2.7 voor component schema) overbrengen in een steriele buis. Warm in een waterbad bij 37 ° C. Tip van de plaat en schud zachtjes tot de cellen aan de onderrand van de putten regelen. Zorgvuldig verwijderen van 2 mL van een oud medium met behulp van een precisiepipet serologische, vermijden van verwijdering van de cellen, en voeg vervolgens 2 mL verse voedingsbodem. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.Opmerking: (belangrijk) het einde moet 2,5 mL/putje van 6WP. Als verdamping optreedt, kan niet verwijderen van 2 mL van oude medium als dit verder van de celculturen uitdrogen zou; in plaats daarvan, het toevoegen van extra medium. Verandering/vernieuwen differentiatie medium met zwaartekracht scheiding De vereiste hoeveelheid NMM met de geschikte onderdelen overbrengen in een steriele buis. Warm in een waterbad bij 37 ° C. De inhoud van de putten overbrengen in een steriele buis, en laat de buis te zitten voor 10 min op RT, voor de scheiding van de zwaartekracht. Gebruik een pipet oud medium verwijderen uit de buis, het verzorgen niet te verwijderen geregeld cellen, resuspendeer in NMM met geschikte onderdelen, en vervolgens distribueren naar de nieuwe AA-gecoate putten. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.Opmerking: (Optioneel) voor gemak, een gedeelte van gestolde voedingsbodem kan worden toegevoegd aan de bestemming wells voorafgaand aan distributie, met differentiatie van cellen geresuspendeerde in een lager volume. Het einde volume moet 2,5 mL/putje van 6WP. 4. protocol 3: Alternatieve 2D differentiatie cultuur Starten en onderhouden van cultuur met behulp van de stappen volgens sectie 3 voor 3D protocol via dag 12 Volg stappen 3.1-3.2.3 en verandering/vernieuwen medium per stap 3.3 en 3.4. Overschakelen naar en te onderhouden als 2D enkelgelaagde cultuur Op dag 13 van differentiatie, volg de instructies voor verandering/vernieuwen medium met zwaartekracht scheiding (stap 3.4), alleen het verspreiden van de cellen/aggregaten aan PLO/LAM beklede plaat (zie stap 1.6) met een volume van het einde van 2.5 mL/goed van 6WP.Opmerking: Het medium kan worden aangevuld met 10 µM RI tijdens het eerste laagje om te helpen de naleving en het voortbestaan van de cellen. (Belangrijk) Het is wenselijk te gelijkmatig op de cellen in de putjes, lage dichtheid of verdringing op de platen te voorkomen, en om de passage (zie stap 4.4) zo nodig. De gewenste grootte van de PLO/LAM gecoate platen (dat wil zeggen, 6WP, 12WP, enz.) moet empirisch worden bepaald, gebaseerd op het tarief van de proliferatie voor de cellijn en doel van het product. Instructies krijgt volumes voor 6WP, en kunnen worden omgezet door halvering voor elke verdubbeling van goed nummer (dat wil zeggen, 2 mL/putje voor 6WP, 1 mL/goed voor 12WP, enz.) Op dag 14, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 en 20 ng/mL FGF2. Vernieuw het medium om de andere dag zoals beschreven in stap 4.3. Op dag 17, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL FGF8B. Vernieuw het medium om de andere dag zoals beschreven in stap 4.3. Op dag 21, door de middellange tot NMM met 100 ng/mL BDNF en 10 ng/mL GDNF te wijzigen. Vernieuw het medium om de andere dag zoals beschreven in stap 4.3. Op dag 28, omzetten in het medium NMM met 100 ng/mL BDNF en 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG 100 ng/mL NT3 en 25 mM KCl. vernieuwen het medium om de andere dag zoals beschreven in stap 4.3. Op dag 35, verzamelen van cellen voor analyse, of te handhaven in hetzelfde medium als stap 4.2.5 voor uitgebreide cultuur (potentiële limiet niet getest). Verandering/vernieuwen differentiatie medium voor 2D cultuur De vereiste hoeveelheid NMM met geschikte onderdelen (Zie de stappen 4.2.2-4.2.5 voor component schema) overbrengen in een steriele buis. Warm in een waterbad bij 37 ° C. Het medium uit putten gecombineerd, voeg vervolgens 2 mL nieuw medium. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.Opmerking: (Optioneel) het einde volume kan worden gehouden bij 2,5 mL/goed voor 6WP, met behulp van een precisiepipet verwijderen van 2 mL van een oud medium en het toevoegen van 2 mL verse voedingsbodem. Reserveren van een gedeelte van de oude kan medium in de putten, en voorkomen dat cellen van contact met de lucht, verminderen schok aan de cellen tijdens verandering stappen. Passage 2D differentiatie cultuur De vereiste hoeveelheid NMM met de geschikte onderdelen (Zie de stappen 4.2.2-4.2.5 voor component schema) overbrengen in steriele buizen, voor het passaging proces en, afzonderlijk, ter voorbereiding van de PLO/LAM beklede plaat voor het ontvangen van cellen gepasseerd. Een aanvulling op het medium voor de bestemming plaat met 10 µM RI. Warm de middellange buizen op RT, of in een waterbad bij 37 ° C. Op onderdelen wilt besparen, is het mogelijk om NMM alleen gebruiken voor het wassen van cellen tijdens de passaging.Opmerking: (belangrijk) als producten worden gebruikt in calcium beeldbewerking experimenten, zorgen naar passage cellen tussen 2 tot 6 dagen vóór het einde van de differentiatie. Gecombineerd het medium uit putten te worden gepasseerd. 300 µL per putje van dissociatie trypsine gebaseerde agent toevoegen (Zie Tabel of Materials), swirl plaat te dekken wells, dan onmiddellijk verwijderen de dissociatie-agent. Toestaan dat de plaat te zitten voor 2 min op RT, dan los van de cellen door te onttrekken op de zijden van de plaat. Voeg 600 µL per putje gedefinieerde trypsine remmer (DTI) en de cellen in DTI overbrengen in een steriele buis met 5 mL NMM. Centrifugeer de buis bij 290 x g gedurende 15 minuten op RT. Aspirate het medium en voeg een andere 5 mL NMM op de buis. Centrifugeer de buis bij 290 x g gedurende 15 minuten op RT. Aspirate het medium en resuspendeer de cellen in het passende medium met RI. Verdelen van de cellen op de plaat van de PLO/LAM met behulp van een splitsing verhouding van 1:1-1:12, afhankelijk van de eerste samenvloeiing, proliferatie tarief en differentiële oorsprong aan de plaat van de bestemming, grootte en onderhouden bij 37 ° C met 5% CO2.