Zebra balığı embriyo geliştirilmesinde bir Vitro tahlil hematopoetik kök ve yaratıcı Quantitate gelişimi (HSPCs) hücreleri
Summary
Burada, hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPCs) embriyonik Zebra balığı quantitate için basit bir yöntem mevcut. Disosiye Zebra balığı HSPCs methylcellulose içinde içine olgun kan ayırt destekleyici faktörler ile kaplama. Bu kan algılama kusurları ve kolayca yapılacak eleme uyuşturucu sağlar sağlar.
Abstract
Hematopoiesis, hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPCs) olgun kan oluşturan farklı hücre soy çok sayıda ayırmak önemli bir hücresel işlemidir. Yalıtım ve bu HSPCs tanımlaması zor çünkü onlar tanımlanmış ex post facto; Onlar sadece kendi farklılaşma belirli hücre soy içine sonra tanımlanabilir. Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) hematopoiesis eğitim için bir model organizma haline gelmiştir. Zebra balığı embriyolar rahimgeliştirmek ve 48 saat sonrası döllenme (hpf) tarafından HSPC farklılaşma değerlendirmek için kesin HSPCs. deneyleri üretilip ve nükleer silahların yayılmasına karşı yetenekleri geliştirilmiştir, nakli kullanan ve sonraki sulandırma hematopoetik sisteminin yanı sıra özel transgenik hatları confocal mikroskobu ile görüntülenmesi. Ancak, bu deneyleri maliyet engelleyici, teknik olarak zor ve zaman alıcı birçok laboratuarlar için vardır. HSPCs değerlendirmek için bir vitro modeli geliştirilmesi olacak maliyet etkin, daha hızlı ve daha önce karşılaştırıldığında daha az mevcut zorluklar HSPC Biyoloji etkileyen mutagenesis ve uyuşturucu ekranlar hızlı bir şekilde değerlendirmek laboratuvarlar sağlayan yöntemlerini açıklanan. HSPCs değerlendirmek için bu roman vitro tahlil ayrışmış kaplama bütün Zebra balığı embriyo ve sadece HSPC farklılaşma ve nükleer silahların yayılmasına karşı teşvik ekleyerek eksojen faktörler tarafından gerçekleştirilir. Embriyolar tek hücrelere ayrışmış ve onları bir tek progenitör hücre ortaya koloni oluşturan birimler (CFUs) oluşturmak neden HSPC destekleyici koloni uyarıcı faktör ile kaplama. Bu deneyleri moleküler yolları daha dikkatli incelenmesi HSPC yayılması, farklılaşma ve araştırmacılar omurgalı hematopoiesis temelleri ve onun bozukluk anlamak sağlayacak yönetmelik sorumlu izin vermelidir hastalık sırasında.
Introduction
Hematopoiesis olgun kan hücreleri bir canlının hayatta kalmak için gerekli sayıda yapma işlemidir. Bu farklılaşma hematopoetik kök hücre (HSCs) içeren bir anahtar gelişimsel olgun kan oluşturan gelişimsel olarak sınırlı hücre tipleri çeşitli içine süreçtir. Bu HSCs böylece sistem asla yorgun ve onlar ölene kadar erken embriyonik gelişme ısrar gerekir kendini yenilemesi gerekir. Omurgalılar, sürekli farklılaşma ve hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPCs) çoğalması yeterince sonrası Mitotik kan hücrelerinin çoğunluğu doldurmak için gerekli olan ve her gün geri dönüşümlü. HSCs ilk kısıtlı progenitör hücre alt kümeleri ayırt tarafından olgun kan hücreleri üretirler; sonunda T, B ve NK hücreleri üretmek, ortak lenfoid ataları (CLPs)1ve granülosit, eritrositler, makrofajlar ve megakaryocytes ortak Miyeloid ataları (CMPs)2 . Bu ataları belirli hücre soy oluşturmak için kararlı olan ve daha fazla daha fazla gelişim kısıtlı progenitör hücreler eritrositler ve trombosit veya granülosit oluşturmak myeloid erythroid ataları (milletvekilleri) gibi içine ayırt etmek bazofil, eozinofil, nötrofiller ve makrofajlar2üreten makrofaj ataları (GMPs). Belirlenmesi ve bu ataları yalıtma önemli moleküler yolları tanımlaması hematopoetik ayrımında yer sağlar ve lösemi gibi birçok hematopoetik hastalığın ortaya bu progenitör hücrelerin düzgün başarısız ayırt etmek.
Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) modeli sistemi embriyonik ve yetişkin hematopoetik çalışmaları için bir anahtar araştırma aracı haline gelmiştir. Zebra balığı için genetik analiz mükellef bulunmaktadır ve bir benzer damarlara ve insanlara hematopoetik sistem filogenetik en düşük omurgalı modeli türü bulunmaktadır. Zebra balığı embriyolar rahim geliştirmek ve 48 saat sonrası içinde fertilizasyon (hpf) oluşturmak HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebra balığı da çok bereketli, tek bir debriyaj 100 yumurta üzerinde döşeme kadın ile büyük ve deneysel çoğaltma için izin. Zebra balığı embriyo optik şeffaf, hematopoetik sistem mikroskobik görselleştirme için izin vardır. Zebra balığı HSCs runx1gibi işaretleme birkaç floresan transgenik satırlık: EGFP balık9, cd41: EGFP10, Balık ve kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 çift pozitif hayvanlar, HSC ortaya çıkması ve genişleme vivo içinde3,4,7,8, canlı, gerçek zamanlı görselleştirme için izin 9. Zebra balığı’nın hızlı nesil zaman ve geliştirme rahim mutagenesis çalışmalar11,12,13,14,15 ve uyuşturucu kullanımı yol açmıştır insan kanı bozuklukları için tedavi edici sözü tutun bileşikler için16,17,18,19,20 eleme. Genel olarak, koruma, varlığı ve kolay geliştirebilme imkanı transgenik hatları ve hızlı yenilenme zamanı hematopoetik sistem Zebra balığı hematopoetik çalışmaları için ucuz, hızlı, esnek ve ideal bir model haline getirdi.
İzole ve HSCs test birçok yöntem içinde memeli hematopoetik sistem geliştirdik. Müfettişler bir arada hücre yüzey reseptörlerinin yanı sıra HSCs21,22,23,24işaretlemek sızma boya25,26HSCs yeteneği yararlanmak için kullanabilir. Sonra onlar etiketlenir, Floresans aktif hücre (FACS) sıralama fiziksel ayırma sağlar. Bir hücreyi bir HSC kanıtlayan sözde HSCs dikim ve uzun vadeli, çok lineage sulandırma kan hücre tipleri olgun her şeyden gözlemleyerek endojen HSPCs yok etmek için bir ev sahibi hayvan irradiating gerektirir. Çok sayıda hücre yüzeyine antikorlar hematopoetik hücreler ve bağışıklık ekimi için eşleşen kolaylaştırmak doğuştan fare suşları karşı olduğundan bu deneyleri de farelerde, iş. Ancak, birkaç Zebra balığı hematopoietik hücre yüzeyine antikorlar oluşturulan kimlik ve HSCs yalıtım engelleyen27, olmuştur. Mark ve Zebra balığı HSCs yalıtmak için en yaygın bir hücre özgü organizatörü sıra floresan protein ifade sayede sürüş Transjenik hayvanlar ile yoludur. Çalışmalar görüntülenir ve HSCs dorsal aort ventral duvar bu tekniği3,4,8,9kullanan mikroskobu ile numaralandırılan. Ultraviyole Zebra balığı28,29 klonal suşları üretilip ve MHC eşlemeli hayvanlar30‘ u başarılı nakli gerçekleştirdik. Ancak, bu teknikler maliyet birçok laboratuvarları engelleyici vardır, teknik olarak zor ve zaman alıcı vardır. Bu sorunlara yönelik olarak laboratuvarları varlığı, nükleer silahların yayılmasına karşı oranları ve HSPCs31,32,33ayırt etme kapasitesi için test etmek için birkaç vitro deneyleri üretilip, 34,35,36. Bu deneyleri yayılması ve HSPCs vitro31,32,33,34,35,36, kurtarma farklılaşma göster hematopoetik kusurları36ve keşfetmek ve sitokinler33,34,35test için verimli bir yöntem. Onlar da HSPC Biyoloji31,32için sorumlu genlerin tanımlamak için kullanılmıştır. Bu çalışmada, bu deneyleri bir adım daha ileri, HSPCs Nefelometri gelişmekte olan bir Zebra balığı embriyo içinde izin alıyoruz. Bu deneyleri de mutant hayvanlar HSPCs sayısında quantitate için kullanılması gereken ve hayvanlar yıkıcı hematopoetik ilaçlar ile tedavi. Aslında, bu deneyleri hızlı, mevcut birkaç teknik sorunlar ve HSPC numaraları quantitate, onların yayılması incelemek ve blok ayrımında araştırmak için ucuz yolu vardır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı modeli sistemi ilkel ve kesin omurgalı hematopoiesis çalışmak için verimli, etkili ve ucuz bir model haline gelmiştir. Hızlı, ucuz ve az teknik zorluklar deneyleri nesil küçük moleküller testi, mutant embriyo çözümlemek ve moleküler pathways HSPC Biyoloji için önemli elucidating için yararlı olabilir. HSPCs in vitro kaplama–dan yetişkin Zebra balığı mutagenesis, sitokinler ve hematopoetik hataları incelemek için etkili bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bu çalışmal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından sağlanan finansman (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S. için), Kaliforniya Devlet Üniversitesi programı için eğitim ve araştırma biyoteknoloji (CSUPERB: omurgalı hematopoetik niş D.L.S. için moleküler kontrolü) ve California State Üniversitesi Chico (için A.C.B.) lisansüstü ofisinden.
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
