התפתחות במבחנה הנועד Quantitate גזע Hematopoietic, קדמון תאים (HSPCs) בפיתוח עוברי דג זברה
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה כדי quantitate hematopoietic גזע קדמון תאים (HSPCs) בדג זברה עובריים. HSPCs של דג זברה חלופה מועדפת הינם מצופה ב- methylcellulose עם גורמים תומכת, המבדילים לדם בוגרת. פעולה זו מאפשרת הגילוי של דם פגמים ומאפשר סמים הקרנת להתנהל בקלות.
Abstract
Hematopoiesis הוא תהליך הסלולר חיוני שבו תאי גזע וקדמון hematopoietic (HSPCs) להבדיל לתוך ריבוי של שושלות תאים שונים המרכיבים את דם בוגרים. בידוד וזיהוי של אלה HSPCs היא קשה כי הם מוגדרים לשעבר פוסט פקטו; הם רק יכולה להיות מוגדרת לאחר בידול שלהם לתוך שושלות תאים מסוים. במהלך העשורים האחרונים, הפך דג זברה (רזבורה rerio) אורגניזם מודל ללמוד hematopoiesis. דג זברה עוברי להתפתח לשעבר עם רחם, וכי על ידי 48 שעות לאחר ההפריה (hpf) יצרו סופית HSPCs. מבחני להעריך בידול HSPC, פותחו יכולות הפצה, ניצול השתלת ובעקבות שיחזור של מערכת hematopoietic בנוסף להמחיש קווים הטרנסגניים מיוחדים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. עם זאת, מבחני אלה הם העלות אוסרני טכנית וקשה, זמן רב עבור מעבדות רבות. פיתוח מודל במבחנה כדי להעריך HSPCs יהיה העלות האפקטיבית, מהיר, ותיאר נוכח קשיים פחות בהשוואה בעבר שיטות, ומאפשר מעבדות להעריך במהירות מסכי התרופות, מוטגנזה מכוונת להשפיע על ביולוגיה HSPC. זה רומן במבחנה הנועד להעריך HSPCs מתבצע על ידי ציפוי הפומבית דג זברה כל העוברים, הוספת גורמים אקסוגניים לקדם רק HSPC בידול והתפשטות. עוברי הפומבית לתוך תאים בודדים, מצופה HSPC-תומכת גורם ממריץ שגורמים להם לייצר המושבה ויוצרים יחידות (CFUs) הנובעות תאים ובתאים יחיד. מבחני האלה צריך לאפשר בחינה זהירה יותר של מסלולים מולקולריים האחראי על התפשטות HSPC, בידול, התקנה, אשר יאפשר לחוקרים להבין את. הפסיכולוגי של חוליות hematopoiesis ואת dysregulation שלה במהלך המחלה.
Introduction
Hematopoiesis היא התהליך של ביצוע ריבוי של תאי דם בוגר נדרש להישרדות של אורגניזם. זה תהליך התפתחותי מפתח המערבת את הבידול של תאי גזע hematopoietic (HSCs) במגוון רחב של סוגי תאים מוגבלת מבחינת המרכיבים דם בוגרים. אלה HSCs עצמית לחדש, כך המערכת לעולם אינו הם חייבים להתמיד של התפתחות עוברית מוקדמת עד מותו. גולגולת, בידול קבוע והתפשטות של תאי גזע וקדמון hematopoietic (HSPCs) יש צורך לחדש בצורה הולמת את רוב תאי דם הם שלאחר mitotic להיות ממוחזרים בכל יום. HSCs יצירת תאי דם בוגרים על-ידי המבדילים הראשון לערכות משנה של ובתאים מוגבלת; נפוץ אבות הלימפה (CLPs)1, אשר בסופו של דבר לייצר תאי T, B, ו- NK, ונפוץ מיאלואידית אבות (CMPs)2 היוצרים גרנולוציטים, אריתרוציטים, מקרופאגים, megakaryocytes. אבות אלה מחויבים יצירת שושלות תאים מסוים, להבדיל עוד יותר לתוך יותר ובתאים מוגבלת מבחינת כגון erythroid מיאלואידית אבות (פיגל) היוצרים אריתרוציטים, טסיות דם, או גרנולוציט אבות מקרופאג (Gmp) היוצרים בזופילים, אאוזינופילים, נויטרופילים ומקרופגים2. זיהוי ובידוד אבות אלה מאפשר זיהוי מסלולים מולקולריים חשוב מעורב בידול hematopoietic, מחלות hematopoietic רבות כגון לוקמיה מתעוררות כאשר אלה ובתאים להיכשל כראוי להבדיל.
במהלך העשורים האחרונים, מערכת מודל דג זברה (רזבורה rerio) הפך כלי מחקר מפתח עבור מחקרים hematopoietic עובריים למבוגרים. דג זברה נתונות ניתוח גנטי והם מינים דגם חוליות phylogenetically הנמוך ביותר שיש להערכת דומים ומערכת hematopoietic לבני אדם. דג זברה עוברי לפתח לשעבר עם רחם, וצור בתוך 48 שעות שלאחר ההפריה (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. דג זברה גם הם הפוריה ביותר, עם הנקבות שוכב מעל 100 ביצים מצמד בודד, מתן אפשרות עבור מדגמים גדולים ושכפול ניסיוני. דג זברה העוברים הם שטיחות שקוף, המאפשר ויזואליזציה מיקרוסקופיים של מערכת hematopoietic. מספר שורות הטרנסגניים פלורסנט דג זברה סימון HSCs כגון runx1: EGFP דגים9, cd41: EGFP דגים10, ו- kdrl:mCherry; cmyb: בעלי חיים GFP3 כפול-חיובית, לאפשר להמחשת בשידור חי, בזמן אמת של מועדון הכדורגל מונפלייה הופעתה והתרחבות ויוו3,4,7,8, 9. של דג זברה דור מהיר זמן ופיתוח לשעבר עם רחם הוביל השימוש בו מוטגנזה מכוונת מחקרים11,12,13,14,15 וסמים הקרנת16,17,18,19,20 שאמורות להחזיק ההבטחה טיפולית בהפרעות דם אנושי. בסך הכל, שימור המערכת hematopoietic, הנוכחות ואת פיתוח קלה של קווים מהונדס, וזמן התחדשות מהירה הפך דג זברה מודל זול, מהיר, גמיש, אידיאלי עבור מחקרים hematopoietic.
פותחו שיטות רבות של בידוד ובדיקה HSCs בתרבית של מערכות hematopoietic. חוקרים יכולים לנצל שילוב של קולטני התא השטח כדי לסמן HSCs21,22,23,24, כמו גם לנצל את היכולת של HSCs בזרימת לצבוע25,26. אחרי, הם מסומנים תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) מאפשר הפרדה פיזית שלהם. להוכיח כי תא HSC מחייב בין חיה המארח כדי להרוס את HSPCs אנדוגני, משתילים בשם HSCs, והתבוננות ארוכת טווח, שושלת היוחסין מרובה שיחזור של כל בוגר סוגי תאים בדם. מבחני אלה פועלות היטב עכברים, שכן ישנם רבים תא-פני נוגדנים נגד תאים hematopoietic וללחצים העכבר המפגרים המאפשרים התאמת המערכת החיסונית עבור השתלת. עם זאת, כמה דג זברה hematopoietic תא-פני נוגדנים כבר שנוצר27, הפרעה של זיהוי ובידוד של HSCs. הדרך הנפוצה ביותר כדי לסמן ולבודד דג זברה HSCs היא עם בעלי חיים מהונדס, לפיה רצף ספציפי תא יזם נוהג הביטוי של החלבון הניאון. מחקרים דמיינו, לספור HSCs בקיר הגחון של אבי העורקים הגבי עם מיקרוסקופ ניצול זו טכניקת3,4,8,9. מעבדות אחרות יצרו זנים המשובטים של דג זברה28,29 , אמורה לבצע השתלה מוצלחת ב- MHC-מתאימים לבעלי חיים30. עם זאת, שיטות אלה העלות אוסרני מעבדות רבות, מבחינה טכנית קשה, הם לארוך זמן רב. כדי לטפל בבעיות אלה, מעבדות יצרו מספר במבחנה מבחני לבדיקת הנוכחות, שיעור התפשטות, והיכולת בידול של HSPCs31,32,33, 35, 34,36. מבחני אלה להראות התפשטות ובידול של HSPCs במבחנה31,32,33,34,35,36, חילוץ פגמים hematopoietic36, שיטה יעילה לגילוי ולבדיקה ציטוקינים33,34,35. הם כבר נעזרו גם לזהות את הגנים אחראית HSPC-ביולוגיה-31,–32. במחקר זה, ניקח את אלה מבחני צעד נוסף, המאפשר כימות של HSPCs של העובר מתפתח דג זברה. מבחני אלה גם יכול להיות מנוצל כדי quantitate את המספר של HSPCs חיות, בעלי חיים שמטופלים בתרופות hematopoietic משובש. בעיקרו של דבר, אלה מבחני מהר, נוכח האתגרים הטכניים אחדים הינם דרכים זולות quantitate מספרי HSPC, לבדוק את ההפצה שלהם, ולחקור בלוקים בידול.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת דגם דג זברה הפך מודל יעיל, יעילה וזולה עבור הלומדים hematopoiesis חוליות פרימיטיביים ומוחלטת. דור של מבחני מהיר, זול, והוא מציג כמה בעיות טכניות יכול להיות מנוצל עבור בדיקות מולקולות קטנות, ניתוח מוטציה עוברי שחקרתי חשוב HSPC ביולוגיה מולקולרית מסלולים. במבחנה ציפוי של HSPCs של דג זברה בוג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון סופק על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (NIH: K01-DK087814-01A1 כדי D.L.S.), התוכנית אוניברסיטת מדינת קליפורניה עבור חינוך ומחקר בתחום הביוטכנולוגיה (CSUPERB: בקרה מולקולרית של הגומחה Hematopoietic חוליות כדי D.L.S.) מ במשרד לתארים צ’יקו באוניברסיטה של מדינת קליפורניה (ל A.C.B.).
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
