Desarrollo de un ensayo In Vitro para cuantificar Progenitor y vástago hematopoyética células (HSPCs) en el desarrollo de embriones de pez cebra

La hematopoyesis es el proceso de hacer que la multitud de células maduras de la sangre necesaria para la supervivencia de un organismo. Es un proceso clave de desarrollo que consiste en la diferenciación de las células madre hematopoyéticas (HSCs) en una variedad de tipos celulares desarrollo restringido que comprenden sangre madura. Las HSCs uno deben renovar para que el sistema nunca se agota y deben persistir de desarrollo embrionario hasta la muerte. En los vertebrados, la constante diferenciación y proliferación de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se necesitan para reponer adecuadamente la mayoría de las células sanguíneas que son poste-mitotic y se reciclan todos los días. HSCs generan células sanguíneas maduras distinguiendo primero en subconjuntos de células progenitoras restringido; común progenitores linfoides (CLPs)¹, que finalmente producen las células T, B y NK y de progenitores mieloides (CMP) común² que generan los granulocitos, eritrocitos, macrófagos y megacariocitos. Estos progenitores comprometidos a generar linajes celulares específicos y además se diferencian en más células progenitoras desarrollo restringido como progenitores mieloide eritroide (MEPs) que generan los eritrocitos y las plaquetas o granulocitos progenitores del macrófago (GMPs) que generan los basófilos, eosinófilos, neutrófilos y los macrófagos². Identificar y aislar a estos progenitores permiten la identificación de importantes vías moleculares implicadas en la diferenciación Hematopoyética y muchas enfermedades hematopoyéticas, como la leucemia se presentan cuando estas células progenitoras no correctamente distinguir.

En las últimas décadas, el sistema de modelo de pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en una herramienta clave de investigación para estudios hematopoyéticos embrionarios y adultos. Pez cebra son susceptible de análisis genético y las especies modelo vertebrados filogenéticamente más bajas que tienen un similar vasculatura y sistema hematopoyético a los seres humanos. Desarrollan de embriones de pez cebra ex útero, y dentro de 48 horas post fecundación (hpf) generan HSPCs^3,4,5,6,7,8. Pez cebra son también altamente fecundo, con hembras sobre 100 huevos en un solo embrague, lo que permite tamaños de muestra grandes y replicación experimental. Los embriones de pez cebra son ópticamente transparentes, que permite la visualización microscópica del sistema hematopoyético. Varias líneas transgénicas fluorescentes del pez cebra marca HSCs como runx1: EGFP pescado⁹, cd41: EGFP peces¹⁰, y kdrl:mCherry; CMYB: animales de doble positivo de³ de GFP, permitir la visualización en tiempo real, vivo de HSC aparición y expansión en vivo^{3,4,7,8, 9}. Generación rápida tiempo y desarrollo ex útero del pez cebra ha conducido a su uso en mutagénesis estudios^{11,12,13,14,15} y proyección^{16,17,18,19,20} compuestos que promesa terapéutica para trastornos de la sangre humana. En general, conservación del sistema hematopoyético, la presencia y desarrollo de líneas transgénicas y tiempo de regeneración rápida ha hecho el pez cebra un modelo barato, rápido, flexible e ideal para estudios hematopoyéticos.

Se han desarrollado numerosos métodos de aislamiento y pruebas de HSCs en mamíferos sistemas hematopoyéticos. Los investigadores pueden utilizar una combinación de receptores de superficie celular para marcar HSCs^21,22,23,24, así como aprovechar la capacidad de HSCs de emanación tinte^25,26. Después están rotuladas, celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación permite su separación física. Demostrando que una célula es una HSC requiere irradiar un animal del anfitrión para destruir HSPCs endógenas, transplante de HSCs putativas y observando que a largo plazo, multilineal reconstitución de todo maduras tipos de células sanguíneas. Estas pruebas funcionan bien en ratones, ya que hay numerosos anticuerpos de superficie celular contra las células hematopoyéticas y cepas consanguíneas de ratón que facilitan el inmunes que empareja para el trasplante. Sin embargo, pocos anticuerpos de superficie de la célula hematopoyética de pez cebra han sido generado²⁷, lo que dificulta la identificación y aislamiento de HSCs. La forma más común de marcar y aislar HSCs de pez cebra es con animales transgénicos, por el que una secuencia de promotor de la célula-específica está impulsando la expresión de una proteína fluorescente. Estudios han visualizado y enumerar las HSCs en la pared ventral de la aorta dorsal con microscopía utilizando esta técnica^3,4,8,9. Otros laboratorios han generado variedades clonales de pez cebra^28,29 y han realizado trasplantes exitosos en animales emparejados MHC³⁰. Sin embargo, estas técnicas son costo prohibitivo para muchos laboratorios, son técnicamente difíciles y son lentos. Para abordar estas cuestiones, los laboratorios han generado diversos estudios en vitro para probar para la presencia, las tasas de proliferación y la capacidad de diferenciación de HSPCs^{31,32,33, 34,35,36}. Estos ensayos muestran proliferación y diferenciación de HSPCs en vitro^{31,32,33,34,35,36}, el rescate de defectos hematopoyéticas³⁶y un método eficaz para descubrir y probar citoquinas^33,34,35. También se han utilizado para identificar los genes responsables de la HSPC biología^31,32. En este estudio, tomamos estos análisis un paso más, permitiendo la cuantificación de HSPCs en un embrión de pez cebra en desarrollo. Estos ensayos también pueden ser utilizados para cuantificar el número de HSPCs en animales mutantes y animales trataron con fármacos hematopoyéticos no disruptivo. En esencia, estos ensayos son rápidos, presentes pocas dificultades técnicas y baratas formas de cuantificar números HSPC, examinar su proliferación e investigar bloques en diferenciación.