تطوير التحليل في المختبر كوانتيتاتي الجذعية المكونة للدم والسلف الخلايا (هسبكس) في تطوير الأجنة الزرد
Summary
نقدم هنا، طريقة بسيطة كوانتيتاتي المكونة للدم الخلايا الجذعية والسلف (هسبكس) في الزرد الجنينية. يتم مطلي هسبكس من الزرد منفصلان في ميثيلسيلولوسي مع عوامل داعمة، التفريق في الدم الناضجة. يسمح هذا الكشف عن الدم العيوب ويسمح للمخدرات الفرز ستجري بسهولة.
Abstract
هيماتوبويسيس هو عملية خلوية أساسية التي تفرق الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (هسبكس) في العديد الأنساب الخلية المختلفة التي تتألف منها الدم الناضجة. يصعب عزل وتحديد هذه هسبكس لأنها محددة الأمر الواقع اللاحق؛ لا يمكن تحديد بعد على التمايز في الأنساب الخلية المحددة. على مدى العقود القليلة الماضية، أصبحت الزرد (دانيو rerio) كائن نموذج لدراسة هيماتوبويسيس. الأجنة الزرد وضع خارج الرحم، وخلال 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf) قد ولدت نهائي هسبكس. فحوصات لتقييم التمايز هسبك وطورت قدرات انتشار استخدام زرع واللاحقة إعادة تشكيل النظام المكونة للدم بالإضافة إلى تصور خطوط المعدلة وراثيا المتخصصة مع الفحص المجهري [كنفوكل]. بيد أن هذه الاختبارات تكلفة باهظة وصعبة من الناحية الفنية، وتستغرق وقتاً طويلاً للعديد من المختبرات. وضع نموذج لتقييم هسبكس في المختبر ستكون فعالة من حيث التكلفة، وأسرع، وصعوبات أقل مقارنة بالسابق ووصف الأساليب، السماح لمختبرات تقييم شاشات الطفرات والعقاقير التي تؤثر على بيولوجيا هسبك بسرعة. هذه الرواية في المختبر فحص لتقييم هسبكس يؤديها تصفيح فصل الزرد كله الأجنة وإضافة عوامل خارجية تعزز فقط هسبك التفريق والانتشار. فصل في الخلايا المفردة ومطلي مع عوامل تحفيز مستعمرة هسبك الداعمة التي تسبب لهم لإنشاء مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) التي تنشأ من خلية واحدة السلف الأجنة. ينبغي أن تسمح هذه فحوصات دراسة متأنية أكثر من المسارات الجزيئية مسؤولة عن انتشار هسبك، والتمايز، والتنظيم، التي سوف تسمح للباحثين لفهم أسس هيماتوبويسيس الفقاريات والتقلبات أثناء المرض.
Introduction
هيماتوبويسيس هو عملية صنع العديد خلايا الدم الناضجة اللازمة لبقاء الكائن الحي. أنها عملية إنمائية رئيسية ينطوي على التفريق بين الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا تنمويا المقيدة التي تتألف منها الدم الناضجة. يجب تجديد هذه هسكس ذاتيا حيث أن النظام لم تستنفد، وأنها يجب أن تستمر من التنمية الجنينية المبكرة حتى الموت. في الفقاريات، هناك حاجة إلى تغذية كافية غالبية خلايا الدم التي يتم بعدها الانقسامية التمايز المستمر وانتشار الخلايا الجذعية والسلف المكونة للدم (هسبكس) ويجري إعادة تدويرها كل يوم. هسكس توليد خلايا الدم الناضجة بالتفريق الأولى إلى مجموعات فرعية خلايا السلف مقيد؛ المشتركة المتكفل اللمفاوية (المعنية)1، والذي في نهاية المطاف إنتاج خلايا تي وب ناغورني-كاراباخ، و المتكفل النقوي (CMPs) المشتركة2 التي تولد المحببة والكريات الحمراء والضامة وميجاكاريوسيتيس. هذه المتكفل ملتزمون بتوليد الأنساب خلية معينة، وكذلك تفرق في المزيد من الخلايا السلف تنمويا المقيدة مثل المتكفل محمر النقوي (MEPs) التي تولد الكريات الحمراء والصفائح الدموية، أو المحببات بلعم موروث (غمبس) التي تولد الحمضات والعدلات، الاسسه والضامة2. تحديد وعزل هذه المتكفل تتيح تحديد المسارات الجزيئية الهامة المشاركة في تمايز المكونة للدم والعديد من الأمراض المكونة للدم مثل اللوكيميا تنشأ عندما تعجز هذه الخلايا السلف بشكل صحيح التفريق.
على مدى العقود القليلة الماضية، أصبح النظام النموذجي الزرد (دانيو rerio) أداة بحث رئيسية للدراسات المكونة للدم الجنينية والكبار. الزرد قابلة للتحليل الجيني والأنواع النموذجية الفقاريات فيلوجينيتيكالي أدنى المفرج مماثلة ونظام المكونة للدم للبشر. تطوير الزرد الأجنة خارج الرحم، وخلال 48 ساعة بعد إنشاء التسميد (hpf) هسبكس3،4،،من56،،من78. الزرد أيضا مثمر جداً، مع الإناث زرع على البيض 100 في مخلب واحد، مما يسمح للعينات ذات الأحجام الكبيرة والنسخ المتماثل التجريبية. الأجنة الزرد شفافة بصريا، مما يسمح لرؤية مجهرية للنظام المكونة للدم. عدة خطوط المعدلة وراثيا الفلورسنت الزرد وسم هسكس مثل runx1: اجفب الأسماك9، cd41: اجفب الأسماك10، و كدرل:مشري؛ كميب: بروتينات فلورية خضراء3 إيجابية مزدوجة الحيوانات، والسماح للتصور في الوقت الحقيقي، والعيش من HSC نشوء وتوسع في فيفو3،4،،من78، 9. الزرد توليد سريعة الوقت والتنمية خارج الرحم أدى إلى استخدامه في الطفرات الدراسات11،،من1213،،من1415 والمخدرات فحص16،17،،من1819،20 للمركبات التي تبشر العلاجية لاضطرابات الدم البشري. عموما، جعلت الحفاظ على المنظومة المكونة للدم، ووجود وسهل تطوير خطوط المحورة وراثيا، ووقت التجديد السريع الزرد نموذجا غير مكلفة وسريعة ومرنة ومثالية للدراسات المكونة للدم.
وقد وضعت أساليب عديدة لعزل واختبار هسكس في الثدييات الأنظمة المكونة للدم. يمكن استخدام المحققين مزيجاً من مستقبلات الخلية السطحية وضع علامة هسكس21،22،،من2324، فضلا عن استغلال قدرة هسكس efflux صبغ25،26. بعد أنها وصفت، يسمح fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) الانفصال الجسدي. تثبت أن خلية هي HSC يتطلب الإشعاعية حيوان مضيف لتدمير هسبكس الذاتية، زرع هسكس المفترضة، ومراقبة إعادة تشكيل طويلة الأجل، ونسب متعددة جميع أنواع خلايا الدم الناضجة. هذه فحوصات تعمل جيدا في الفئران، كما أن هناك العديد من الأجسام المضادة سطح الخلية ضد الخلايا المكونة للدم وسلالات الماوس الفطرية التي تيسر مطابقة المناعي للزرع. ومع ذلك، قد القليلة الزرد سطح الخلية المكونة للدم أجسام ولدت27، التي تعوق تحديد وعزل هسكس. الطريقة الأكثر شيوعاً للاحتفال وعزل هسكس الزرد مع الحيوانات المحورة وراثيا، حيث يقود تسلسل منظم خلية محددة التعبير بروتين فلوري في. وقد تصور الدراسات وتعداد هسكس في الجدار البطني للشريان الاورطي الظهرية مع الفحص المجهري استخدام هذا الأسلوب3،4،،من89. مختبرات أخرى قد ولدت ضغوطا الاستنساخ الزرد28،29 وإجراء عمليات الزرع الناجحة في الحيوانات مطابقة MHC30. ومع ذلك، هذه التقنيات هي التكلفة الباهظة للعديد من المختبرات ويصعب من الناحية الفنية، وهي مضيعة للوقت. لمعالجة هذه القضايا، قد ولدت مختبرات عدة فحوصات في المختبر لاختبار الوجود ومعدلات انتشار وقدرة التمايز، هسبكس31،،من3233 35،،من 3436. إظهار هذه فحوصات الانتشار والتفريق بين هسبكس في المختبر31،32،،من3334،35،36، إنقاذ 36من عيوب المكونة للدم، ووسيلة فعالة لاكتشاف واختبار السيتوكينات33،،من3435. وقد استخدمت أيضا لتحديد الجينات المسؤولة عن هسبك البيولوجيا31،32. في هذه الدراسة، نأخذ هذه الاختبارات خطوة أخرى، مما يتيح كوانتيتيشن هسبكس في جنينا الزرد نامية. كما يمكن أن تستخدم هذه الاختبارات قوانتيتاتي عدد هسبكس في الحيوانات المسخ والحيوانات تعامل مع الأدوية المكونة للدم التخريبية. في جوهرها، هذه فحوصات سريعة، وهذا من التحديات التقنية القليلة، وهي طرق غير مكلفة كوانتيتاتي أرقام هسبك ودراسة انتشارها، والتحقيق في كتل في التفريق.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أصبح النظام النموذجي الزرد نموذجا كفؤة وفعالة وغير مكلفة لدراسة هيماتوبويسيس الفقاريات البدائية ونهائي. ويمكن استخدام جيل فحوصات سريعة وغير مكلفة، ويقدم بعض الصعوبات التقنية لاختبار الجزيئات الصغيرة وتحليل الأجنة متحولة، وتوضيح المسارات الجزيئية الهامة للبيولوجيا هسبك. في المخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل من “معاهد الصحة الوطنية” (المعاهد الوطنية للصحة: K01-DK087814-01A1 إلى D.L.S.)، “برنامج جامعة كاليفورنيا الولاية” للتعليم والبحوث في مجال التكنولوجيا الأحيائية (كسوبيرب: “السيطرة الجزيئية” من “الفقاريات مكانة المكونة للدم” إلى D.L.S.) ومن مكتب الدراسات العليا في جامعة ولاية كاليفورنيا في تشيكو (إلى A.C.B.).
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
