Разработка в Vitro Assay чтобы Quantitate гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в развитии эмбрионов у рыбок данио

Кроветворения — это процесс превращения множество зрелых клеток крови, необходимые для выживания организма. Это ключевой процесс развития, который включает дифференциация гемопоэтических стволовых клеток (СКК) в различные типы развивающих ограничены клеток, которые составляют пожилые крови. Эти СКК должны самостоятельно обновлять так, что система никогда не исчерпаны, и они должны сохраняться от раннего эмбрионального развития вплоть до смерти. В позвоночных, постоянное дифференциации и распространения гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) необходимо адекватно пополнить большинство клеток крови, которые после митотическая и перезапуск каждый день. СКК генерировать зрелые клетки крови, первый дифференцироваться в подмножества ограниченного прародитель клеток; Общие лимфоидные предшественники (МЦУЗ)¹, который в конечном счете производят T, B и NK клеток и общих миелоидного прародителями (CMPs)² , генерировать гранулоциты, эритроциты, макрофаги и megakaryocytes. Эти предшественники привержены генерации линий определенных ячеек и далее дифференцироваться в более развивающих ограниченный прародителя клетки как миелоидного эритроидные предшественники (MEP) которые генерируют эритроцитов и тромбоцитов или гранулоцитов прародителями макрофагов (ГИП), которые генерируют²базофилы, эозинофилов, нейтрофилов и макрофагов. Выявление и изоляция этих прародителями позволяет выявлять важные молекулярные пути участвующих в дифференциации кроветворных и многие кроветворных заболеваний, таких как лейкемия возникают, когда эти клетки-предшественники не правильно дифференцировать.

За последние несколько десятилетий данио рерио (Danio рерио) модель системы стала ключевым исследовательского инструмента для исследования гемопоэтических эмбриональных и взрослых. Данио рерио поддаются генетический анализ и филогенетически низкие видов позвоночных модели, которые имеют аналогичные сосудистую и Кроветворная система для людей. Данио рерио эмбрионов развивать ex внутриутробно, и в течение 48 часов пост оплодотворение (hpf) генерировать HSPCs^3,4,5,6,,78. Данио рерио являются также весьма плодотворного, с самками, отстаивается 100 яиц в одном сцепления, позволяя для больших выборок и экспериментальной репликации. Данио рерио эмбрионов оптически прозрачным, позволяя микроскопических визуализации кроветворной системы. Несколько флуоресцентные трансгенных линий данио рерио, маркировка СКК например runx1: EGFP рыбы⁹, cd41: EGFP рыбы¹⁰, и kdrl:mCherry; cmyb: GFP³ двойной инфицированных животных, позволяют жить в реальном времени визуализации HSC возникновение и расширение в естественных условиях^{3,4,,78, 9}. Данио рерио быстрого поколения время и развития бывших utero привела к его использования мутагенеза исследования^{11,12,13,,1415} и наркотиков Скрининг^{16,17,18,,1920} для соединений, которые держат терапевтические обещания для расстройств крови человека. В целом сохранению кроветворной системы, присутствие и легко развития трансгенных линий и быстрой регенерации времени сделал данио рерио недорогой, быстрый, гибкий и идеальная модель для гемопоэтических исследований.

Были разработаны многочисленные методы изоляции и тестирования СКК в млекопитающих кроветворной систем. Исследователи могут использовать сочетание поверхности рецепторы клеток марка СКК^21,,2223,24, а также использовать способность СКК измеряем краситель^25,26. После того, как они помечены, активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) позволяет их физическое разделение. Доказав, что ячейка HSC требует облучения хост животных, чтобы уничтожить эндогенного HSPCs, пересадка предполагаемого СКК и наблюдая за долгосрочный, мульти линии растворения всех Зрелые типы клеток крови. Эти анализы хорошо работают в мышей, поскольку есть многочисленные клетк поверхности антител против гемопоэтических клеток и инбредные мыши штаммов, которые облегчают иммунной соответствия для трансплантации. Однако несколько данио рерио гемопоэтических клеток поверхности антитела были созданные²⁷, препятствуя выявление и изоляция СКК. Наиболее распространенный способ пометить и изолировать данио рерио СКК-трансгенных животных, whereby клеток конкретных промоутер последовательность является движущей флуоресцентных белков. Исследования имеют визуализируется и перечислил СКК в брюшной стенке грудной аорты с микроскопией, используя этот метод^3,4,8,9. Другие лаборатории породили клоновых штаммов данио рерио^28,29 и выполнили успешные трансплантации в MHC-согласованной животных³⁰. Однако эти методы являются стоимость непомерно много лабораторий, технически трудно и много времени. Для решения этих вопросов, лаборатории породили несколько в vitro анализов для проверки присутствия, темпы распространения и возможности дифференциации HSPCs^{31,,3233, 34,35,36}. Эти анализы показывают пролиферации и дифференцировки HSPCs в vitro^{31,,3233,34,35,36}, спасение Кроветворная дефекты³⁶и эффективный метод для обнаружения и тестирования цитокинов^33,34,35. Они также были использованы для идентификации генов, ответственных за HSPC биологии^31,32. В этом исследовании мы принимаем эти анализы на шаг дальше, позволяя количественный HSPCs развивающихся zebrafish эмбриона. Эти анализы также могут быть использованы чтобы quantitate количество HSPCs в мутанта животных и животных лечат гемопоэтических подрывной препаратами. По сути эти анализы являются быстрый, настоящий несколько технических проблем и недорогих способов quantitate HSPC чисел, изучить их распространения, и расследовать блоков в дифференциации.