Ontwikkeling van een In Vitro Assay voor het kwantificeren van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) bij de ontwikkeling van de zebravis embryo 's

Haematopoiese is het proces van het maken van de veelheid van rijpe bloedcellen die nodig is voor de overleving van een organisme. Het is een belangrijke developmental proces waarbij de differentiatie van hematopoietische stamcellen (HSCs) in een verscheidenheid van verstandelijk beperkte celtypes waaruit volwassen bloed. Deze HSCs moeten zelf vernieuwen zodat het systeem nooit uitgeput is en ze van vroege embryonale ontwikkeling tot dood aanhouden moeten. In gewervelde dieren, constante differentiatie en proliferatie van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSPCs) zijn nodig voor voldoende vullen de meerderheid van de bloedcellen die post mitotische zijn en elke dag worden gerecycled. HSCs genereren volwassen bloedcellen door de eerste differentiëren in subsets van beperkte voorlopercellen; gemeenschappelijke lymfoïde progenitoren (CLPs)¹, die uiteindelijk produceren T, B en NK-cellen, en gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMPs)² die het genereren van Granulocyten, erytrocyten, macrofagen en megakaryocytes. Deze progenitoren zich inzetten voor het genereren van specifieke cel geslachten, en verder onderscheiden in meer verstandelijk beperkte voorlopercellen zoals myeloïde erythroid progenitoren (Europarlementariërs) die het genereren van erytrocyten en bloedplaatjes of granulocyt macrophage progenitoren (GGP’s) die het genereren van basofielen, eosinofielen, neutrofielen en macrofagen². Identificeren en het isoleren van deze progenitoren maakt de identificatie van belangrijke moleculaire pathways betrokken bij hematopoietische differentiatie en vele hematopoietische ziekten zoals leukemie ontstaan bij deze voorlopercellen niet goed onderscheiden.

In de afgelopen decennia, is het systeem van zebravissen (Danio rerio) model een belangrijke onderzoeksinstrument voor embryonale en volwassen hematopoietische studies geworden. Zebravis zijn vatbaar voor genetische analyse en de fylogenetisch laagste gewervelde model soorten die een vergelijkbare therapieën en hematopoietische systeem voor de mens hebben. Zebravis embryo’s ontwikkelen ex utero, en binnen 48 uur bericht genereren bevruchting (hpf) HSPCs^3,4,5,6,7,8. Zebravis zijn ook zeer vruchtbare, met vrouwtjes leggen over 100 eieren in een interne koppeling, waardoor voor grote steekproeven en experimentele replicatie. Zebravis embryo’s zijn optisch transparant, waardoor voor microscopische visualisatie van het hematopoietische systeem. Enkele fluorescerende transgene coderegels zebrafish markering HSCs zoals runx1: EGFP vissen⁹, cd41: EGFP vissen¹⁰, en kdrl:mCherry; cmyb: GFP³ dubbel-positieve dieren, voorzien van live, real-time visualisatie van HSC ontstaan en de uitbreiding in vivo^{3,4,7,8, 9}. Van de zebravis snelle generatie tijd en ontwikkeling ex utero heeft geleid tot het gebruik ervan in de mutagenese studies^{11,12,13,14,15} en drug screening^{16,17,18,19,20} voor verbindingen die houden van therapeutische belofte voor menselijk bloed stoornissen. Globaal, instandhouding van het hematopoietische systeem, de aanwezigheid en eenvoudige ontwikkeling van transgene lijnen en snelle regeneratietijd geboekt de zebravis een goedkoop, snel, flexibel en ideaal model voor hematopoietische studies.

Tal van methoden van isoleren en testen van HSCs zijn in zoogdieren hematopoietische systemen ontwikkeld. Onderzoekers kunnen gebruik maken van een combinatie van cel oppervlakte receptoren aan mark van HSCs^21,22,23,24, evenals het benutten van het vermogen van HSCs om efflux kleurstof^25,26. Nadat ze zijn aangeduid, kan fluorescentie-activated cell sorting (FACS) hun fysieke scheiding. Waaruit blijkt dat een cel een HSC is vereist het bestralen van een dier van de gastheer te vernietigen van endogene HSPCs, overplanten van vermeende HSCs, en op lange termijn, multi lineage reconstitutie van alle oudere bloed celtypes observeren. Deze testen werken goed in muizen, want er zijn talrijke celoppervlak antilichamen tegen hematopoietische cellen en muis ingeteelde stammen die vergemakkelijken immuun matching voor transplantatie. Echter, zijn paar zebrafish hematopoietische celoppervlak antilichamen gegenereerde²⁷, belemmeren de identificatie en de isolatie van de HSCs. De meest gebruikelijke manier om te markeren en te isoleren van de zebravis HSCs is met transgene dieren, waarbij een reeks van cel-specifieke promotor is het besturen van een fluorescerende eiwit expressie. Studies hebben gevisualiseerd en HSCs in de ventrale muur van de dorsale aorta opgesomd met microscopie met behulp van deze techniek^3,4,8,9. Andere laboratoria hebben gegenereerd klonale stammen van zebravis^28,29 en succesvolle transplantaties in MHC-matched dieren³⁰hebben uitgevoerd. Echter deze technieken worden kosten onbetaalbaar met veel laboratoria zijn technisch gezien moeilijk en tijdrovend zijn. Om deze kwesties te behandelen, hebben laboratoria gegenereerd verscheidene in vitro testen om te testen voor de aanwezigheid, de proliferatie-tarieven en de capaciteit van de differentiatie van HSPCs^{31,32,33, 34,35},^,36. Deze onderzoeken tonen de proliferatie en differentiatie van HSPCs in vitro^{31,32,33,34,35},^,36, de redding van hematopoietische gebreken³⁶, en een efficiënte methode voor het ontdekken en testen van cytokines^33,34,35. Ze hebben ook gebruikt ter identificatie van genen die verantwoordelijk zijn voor^31,32van de biologie van de HSPC. In deze studie nemen wij deze testen een stap verder, waardoor de kwantificatie van HSPCs in een zich ontwikkelende zebrafish embryo. Deze testen kunnen ook worden gebruikt om het kwantificeren van het aantal HSPCs in mutant dieren en dieren behandeld met hematopoietische-ontwrichtende drugs. Kortom, deze tests zijn snel, huidige enkele technische uitdagingen, en goedkope manieren om te kwantificeren HSPC nummers, hun verspreiding te onderzoeken en onderzoeken van blokken in differentiatie.