Développement d’un test In Vitro pour doser les progéniteurs et souches hématopoïétiques cellules (HSPCs) dans le développement des embryons de poisson-zèbre

L’hématopoïèse est le processus de fabrication de la multitude de cellules sanguines matures nécessaires à la survie de l’organisme. C’est un processus de développement clé qui implique la différenciation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans une variété de types de cellules développemental restreinte qui composent le sang mature. Ces CSH doit se renouveler afin que le système n’est jamais épuisé et ils doivent persister depuis le début du développement embryonnaire jusqu’à la mort. Chez les vertébrés, la constante différenciation et la prolifération des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) sont nécessaires pour remplir adéquatement la majorité des cellules sanguines qui sont post-mitotiques et être recyclé tous les jours. CSH génère des cellules sanguines matures en premier différenciant en sous-ensembles de cellules progénitrices restreinte ; commune cellules souches lymphoïdes (SPDP)¹, qui finit par produire des cellules T et B NK et commune progéniteurs myéloïdes (CMPs)² qui génèrent les granulocytes, les érythrocytes, les macrophages et les mégacaryocytes. Ces cellules souches se sont engagés à générer des lignées cellulaires spécifiques et davantage se différencient en plus progéniteurs développemental restreints tels que les progéniteurs érythroïdes myéloïde (députés) qui génèrent des érythrocytes et des plaquettes ou des granulocytes progéniteurs de macrophages (BPF) qui génèrent des basophiles, éosinophiles, neutrophiles et les macrophages². Identifier et isoler ces cellules souches permettent l’identification d’importants mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation hématopoïétique et de nombreuses maladies hématopoïétiques telles que la leucémie se posent lorsque ces cellules progénitrices ne pas correctement faire la différence.

Dans les dernières décennies, le système de modèle de poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un outil de recherche d’études hématopoïétiques embryonnaires et adultes. Poisson zèbre se prêtent à des analyses génétiques et sont les espèces de vertébrés modèle phylogénétiquement plus bas qui ont une vascularisation similaire et le système hématopoïétique aux humains. Développent des embryons de poisson-zèbre ex utero, et dans les 48 heures après la fécondation (hpf) générer HSPCs^3,4,5,6,7,8. Poisson zèbre sont également très fécondes, les femelles portant sur 100 oeufs dans une seule couvée, permettant la réplication expérimentale et de vastes échantillons. Des embryons de poisson-zèbre sont optiquement transparentes, permettant une visualisation microscopique du système hématopoïétique. Plusieurs lignées transgéniques fluorescentes de poisson-zèbre marquage autorenouveler comme runx1: EGFP poisson⁹, cd41: EGFP pêcher¹⁰, et kdrl :mCherry ; CMJN: GFP³ double-positifs animaux, permettent pour la visualisation en temps réel de HSC émergence et l’expansion in vivo^{3,4,7,8, 9}. Génération rapide temps et développement ex utero du poisson-zèbre a mené à son utilisation en mutagénèse études^{11,12,13,14,15} et drogues le dépistage de^{16,17,18,19,20} pour les composés qui sont thérapeutiques prometteuses pour troubles du sang humain. Dans l’ensemble, conservation du système hématopoïétique, la présence et le développement facile des lignées transgéniques et l’heure de régénération rapide a fait le poisson-zèbre, un modèle peu coûteux, rapide, flexible et idéal pour les études hématopoïétiques.

Nombreuses méthodes d’isolement et CSH ont été développés dans des systèmes hématopoïétiques chez les mammifères. Les enquêteurs peuvent utiliser une combinaison de récepteurs membranaires à Marc autorenouveler^21,22,23,24, en plus d’exploiter la capacité des CSH à efflux colorant^25,26. Après qu’ils sont étiquetés, cellule activée par fluorescence triant (FACS) permet leur séparation physique. Ce qui prouve qu’une cellule est un HSC nécessite irradier un animal hôte pour détruire HSPCs endogènes, repiquage autorenouveler putatif et en observant les reconstitution à long terme, lignée multiples de tous matures des types de cellules sanguines. Ces tests fonctionnent bien chez la souris, comme il y a de nombreux anticorps de surface cellulaire contre les cellules hématopoïétiques et souches de souris consanguines qui facilitent le système immunitaire correspondant à la transplantation. Cependant, quelques poissons zèbres hématopoïétiques anticorps de surface cellulaire ont été généré²⁷, empêchant l’identification et l’isolement des CSH. La façon la plus courante pour marquer et isoler le poisson-zèbre CSH est avec des animaux transgéniques, selon lequel une séquence promotrice de la spécificité cellulaire est le moteur expression de la protéine fluorescente. Études ont visualisé et énuméré les CSH dans la paroi ventrale de l’aorte dorsale au microscope utilisant cette technique^3,4,8,9. Autres laboratoires ont généré des souches clonales du poisson-zèbre^28,29 et ont effectué des greffes réussies dans animaux appariés MHC³⁰. Toutefois, ces techniques sont inabordable pour de nombreux laboratoires, sont techniquement difficiles et demandent beaucoup de temps. Pour résoudre ces problèmes, les laboratoires ont généré plusieurs essais in vitro pour tester la présence, le taux de prolifération et la capacité de différenciation des HSPCs^{31,32,33, 34,35,},³⁶. Ces tests montrent la prolifération et la différenciation des HSPCs in vitro^{31,32,33,34,35,36}, le sauvetage des hématopoïétiques défauts³⁶et une méthode efficace pour découvrir et tester les cytokines^33,34,35. Ils ont également été utilisés pour identifier les gènes responsables de la CSPH biologie^31,32. Dans cette étude, nous prenons ces tests un peu plus loin, ce qui permet le dosage des HSPCs dans un embryon de poisson zèbre. Ces tests peuvent également être utilisées pour quantifier le nombre de HSPCs chez les animaux mutants et animaux traités avec des médicaments hématopoïétiques sans interruption. Essentiellement, ces tests sont rapides, présentes quelques difficultés techniques et des moyens peu coûteux pour quantifier les numéros HSPC, examiner leur prolifération et enquêter sur les blocs dans la différenciation.