Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

Hematopoiese é o processo de fazer a multidão de células maduras do sangue necessário para a sobrevivência do organismo. É uma chave no desenvolvimento do processo que envolve a diferenciação de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) em uma variedade de tipos de células desenvolvente restrito que compõem o sangue maduro. Estes linfócitos auto devem renovar para que o sistema nunca está esgotado e eles devem persistir de desenvolvimento embrionário precoce até à morte. Nos vertebrados, constante diferenciação e proliferação de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são necessários para repor adequadamente a maioria das células do sangue que são pós mitóticas e sendo reciclados todos os dias. Linfócitos geram células maduras do sangue por primeira diferenciação em subconjuntos de células progenitoras restrito; comum progenitores linfoides (CLPs)¹, que eventualmente produzir células T, B e NK e comum progenitores mieloides (CMPs)² que geram granulócitos, eritrócitos, macrófagos e megacariócitos. Estes progenitores estão empenhados em gerar linhagens de células específicas e diferenciarem ainda mais em mais células progenitoras desenvolvente restrito como progenitores mieloide eritroide (MEPs) que geram eritrócitos e plaquetas ou granulócitos progenitores do macrófago (GMPs) que geram basófilos, eosinófilos, neutrófilos e macrófagos². Identificando e isolando esses progenitores permitem a identificação de importantes vias moleculares envolvidos na diferenciação hematopoiética e muitas doenças hematopoiéticas, como a leucemia surgem quando essas células progenitoras não corretamente Diferencie-se.

Ao longo das últimas décadas, o modelo de sistema de peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se uma ferramenta chave de pesquisa para estudos hematopoiéticas adultas e embrionárias. Zebrafish são passível de análise genética e são as espécies de vertebrados modelo filogeneticamente menores que têm um sistema vascular semelhante e sistema hematopoiético aos seres humanos. Desenvolvem de embriões de zebrafish ex utero, e dentro de 48 horas pós fertilização (hpf) gerar HSPCs^3,4,5,6,7,8. Zebrafish são também altamente fecundo, com fêmeas deitado sobre 100 ovos em uma única embreagem, permitindo a replicação experimental e tamanhos de amostra grande. Zebrafish embriões são opticamente transparentes, permitindo a visualização microscópica do sistema hematopoiético. Várias linhas de transgênicas fluorescentes de zebrafish marcando linfócitos como runx1: EGFP peixe⁹, cd41: EGFP peixe¹⁰, e kdrl:mCherry; CMap: animais de duplo-positivo do GFP³ , permitem a visualização em tempo real de HSC surgimento e expansão na vivo^{3,4,7,8, 9}. Geração rápido tempo e desenvolvimento ex utero do zebrafish conduziu a seu uso em mutagênese estudos^{11,12,13,14,15} e drogas rastreio de^{16,17,18,19,20} para compostos que mantêm a promessa terapêutica para distúrbios do sangue humano. Em geral, conservação do sistema hematopoiético, a presença e o desenvolvimento fácil de linhas transgénicas e tempo de regeneração rápida fez o zebrafish um modelo barato, rápido, flexível e ideal para estudos hematopoiéticos.

Numerosos métodos de isolamento e testes de linfócitos foram desenvolvidos em mamíferos sistemas hematopoiéticos. Os investigadores podem utilizar uma combinação de receptores de superfície celular para marcar linfócitos^21,22,23,24, bem como explorar a capacidade dos linfócitos de efluxo tintura^25,26. Depois que eles são rotulados, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação permite que a sua separação física. Provar que é uma célula de um HSC requer irradiando um animal hospedeiro para destruir HSPCs endógenos, transplantando linfócitos putativos e observando a longo prazo, linhagem multi reconstituição de todos amadurecem tipos de células do sangue. Estes ensaios funcionam bem em ratos, como existem numerosos da pilha-superfície anticorpos contra células hematopoiéticas e linhagens puras do mouse que facilitam a correspondência imune para transplante. No entanto, alguns zebrafish anticorpos de superfície de células hematopoiéticas foram gerados²⁷, dificultando a identificação e isolamento de linfócitos. A maneira mais comum para marcar e isolar linfócitos zebrafish é com animais transgénicos, segundo o qual uma sequência do promotor celular específico está dirigindo expressão de uma proteína fluorescente. Estudos têm visualizado e enumerado de linfócitos na parede ventral da aorta dorsal com microscopia utilizando esta técnica^3,4,8,9. Outros laboratórios geraram variedades clonais de zebrafish^28,29 e realizaram transplantes bem sucedidos em animais MHC-combinadas³⁰. No entanto, essas técnicas são custo proibitivo para muitos laboratórios são tecnicamente difíceis e são demoradas. Para solucionar esses problemas, laboratórios têm gerado vários ensaios em vitro para testar para a presença, as taxas de proliferação e a capacidade de diferenciação de HSPCs^{31,32,33, 34,35,36}. Estes ensaios mostram proliferação e diferenciação dos HSPCs em vitro^{31,32,33,34,35,36}, o resgate de hematopoiéticas defeitos³⁶e um método eficiente para descobrir e testar citocinas^33,34,35. Eles também têm sido utilizados para identificar os genes responsáveis pela HSPC biologia^31,32. Neste estudo, tomamos estes ensaios um passo adiante, permitindo a quantificação de HSPCs em um embrião em desenvolvimento do zebrafish. Estes ensaios também podem ser utilizados para quantificar o número de HSPCs em animais mutantes e os animais tratados com drogas hematopoiéticas interrupções. Em essência, estes ensaios são rápidos, presentes alguns desafios técnicos e maneiras baratas de dosar números HSPC, examinar sua proliferação e investigar blocos na diferenciação.