ゼブラフィッシュ初期胚細胞 (HSPCs) を造血幹・前駆細胞の量的にIn Vitroアッセイの開発
Summary
造血幹・前駆細胞 (HSPCs) ゼブラフィッシュ胚を量的に簡単な方法を紹介します。成熟した血液へと分化支持の要因とセルロースでめっき解離ゼブラフィッシュから HSPCs います。これにより血液の検出欠陥や薬剤のスクリーニングを簡単に行なうことができます。
Abstract
造血は造血幹・前駆細胞 (HSPCs) が分化成熟した血液を構成する異なる細胞系譜の多数、重要な細胞プロセスです。これらの HSPCs の分離・同定は難しいので定義された事後彼らは、特定のセルにその分化後だけ定義できます。過去数十年間、ゼブラフィッシュ (動脈分布) 造血を調査するモデル有機体となっています。ゼブラフィッシュ胚の子宮 ex、開発し、48 時間後受精 (hpf) によって HSPC 分化を評価するために決定的な HSPCs アッセイを生成していると移植を利用した増殖機能が開発されているとそれ以降。共焦点顕微鏡を用いた特殊な形質転換線の可視化に加えて造血システムの再構成。ただし、これらの試金はコストが法外な技術的に困難で、多くの実験室では時間がかかるです。HSPCs を評価するための in vitroモデルの開発はより速く、費用対効果になるし、以前に比べて現在の少ない困難に HSPC 生物学に影響を与える突然変異や薬物の画面をすばやく評価する所を可能にするメソッドが記述されています。HSPCs を評価するためにこの小説の in vitroアッセイは、めっき解離全体ゼブラフィッシュ胚とだけ HSPC の分化と増殖を促進する追加の外因性の要因によって実行されます。胚が単一のセルに分離される、単一の前駆細胞から生じるコロニー形成単位 (CFUs) を生成させる HSPC 支持のコロニー刺激因子とメッキします。これらの試金からの分子経路のより注意深い検査ように HSPC 増殖、分化および脊椎動物の造血の基盤とその調節不全を理解する研究者を可能にする規制を担当中に病。
Introduction
増結は、生物の生存に必要な成熟した血液細胞の多数を作るプロセスです。成熟した血液を構成する発達制限携帯各種に造血幹細胞 (造血) の分化を含むキーの発達プロセスです。これらの造血システムが枯渇しないように、初期胚から死に至るまで維持されている必要があります更新する必要があります。ポスト mitotic の血液細胞の大半を十分に補充するために、脊椎動物の造血幹・前駆細胞 (HSPCs) の定数の分化・増殖を必要な毎日がリサイクルされていると。HSCs は制限された幹細胞のサブセットに最初の差別化によって成熟した血液細胞を生成します。一般的なリンパ球前駆細胞 (CLPs)1、最終的に T、B、NK 細胞を作り出す、および一般的な骨髄前駆細胞 (Cmp)2顆粒球、赤血球、巨核球マクロファージを生成します。これらの前駆細胞が特定の細胞系譜を生成するのにコミットしているし、骨髄赤芽球系前駆細胞 (Mep) 顆粒球や血小板、赤血球を生成するなどの詳細の発達制限前駆細胞へと分化好塩基球、好酸球、好中球、マクロファージの2を生成するマクロファージ前駆細胞 (省)。識別し、これらの前駆細胞を分離することにより重要な分子経路の同定、造血分化に関与して白血病などの多くの造血器疾患発生これらの前駆細胞が正常に失敗するとき区別します。
過去数十年間、ゼブラフィッシュ (動脈分布) モデル システム胎児および成体造血研究重要な研究ツールとなっています。ゼブラフィッシュ遺伝子解析に適しているで、系統発生的に最も低い脊椎動物のモデル種と同様血管と人間に造血システムを持つ。Zebrafish の胚が子宮、ex開発し、48 時間ポスト内受精 (hpf) は HSPCs3,4,5,6,7、8を生成します。ゼブラフィッシュは、また非常に肥沃な女性シングル クラッチで 100 個の卵を産卵大きいサンプルの大きさおよび実験的レプリケーションを可能にします。Zebrafish の胚が光学的に透明な造血系の顕微可視化を可能にします。蛍光遺伝子組換え数行ゼブラフィッシュrunx1など HSCs をマーキング: EGFP 魚9、 cd41: EGFP 魚10、およびkdrl:mCherry;cmyb: GFP3二重肯定的な動物、HSC の出現と拡大生体内で3,4,7,8、ライブ、リアルタイムの可視化を可能にします。 9。ゼブラフィッシュの速い世代時間と開発子宮 exにおける突然変異誘発の研究11,12,13,14,15と薬物使用につながっています。16,17,18,19、20人の血液疾患の治療の約束を保持する化合物をスクリーニングします。全体的にみて、造血系、存在と形質転換線、および迅速な再生時間を容易に開発の保全したゼブラフィッシュ造血の研究のための安価な迅速、柔軟、かつ理想的なモデル。
分離して造血をテストの多数の方法は、哺乳類の造血システムで開発されています。調査官は、流出色素25,26HSCs の能力を悪用すると同様、HSCs21,22,23,24をマークに細胞表面受容体の組み合わせを利用できます。彼らにラベルを付ける蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えの物理的な分離ができます。セルが、HSC であることを証明するには、内因性 HSPCs、推定 HSCs 移植と成熟した血液細胞の種類すべての長期的な多系統の再構成を観察することを破壊するホスト動物を照射する必要があります。これらのアッセイは、造血細胞移植免疫のマッチングを容易にする近交系マウス系統と多数細胞表面の抗体があるのでマウスでよくはたらきます。ただし、いくつかのゼブラフィッシュ造血細胞表面の抗体は、生成された27, 同定と HSCs の分離を妨げることをされています。マークし、ゼブラフィッシュ HSCs を分離する最も一般的な方法は、トランスジェニック動物、セル固有のプロモーターは、蛍光タンパク質の発現を運転するという。研究は可視化して、背側大動脈の腹側の壁の HSCs の列挙にはこのテクニック3,4,8,9を利用した顕微鏡。他の研究室は、ゼブラフィッシュ28,29系統のクローンを生成しているし、MHC 一致動物30の成功移植を実行しています。ただし、これらのテクニックは、多くの実験室は膨大なコスト、技術的に困難でありは時間がかかる。これらの問題に対処するため研究所は存在、増殖率と HSPCs31,32,33、分化能力をテストするためのいくつかの in vitroアッセイを生成しています。 34,35,36。これらの試 HSPCs体外31,32,33,34,35,36, の救助の増殖・分化を示す造血障害36と発見とサイトカイン33,34,35のテストのための効率的な方法です。彼らはまた、HSPC 生物学31,32の遺伝子を識別するために利用されています。この研究では、私たちが一歩これらの試さらに、ゼブラフィッシュの胚の HSPCs の定量を可能します。これらの試また変異動物の HSPCs の数を量的に利用することができ、動物が破壊的造血薬で治療します。本質的に、これらの試金は高速、現在のいくつかの技術的な課題、HSPC 数字を量的に表わす、彼らの増殖を調べるし、分化におけるブロックを調査する安価な方法をあります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュ モデル システムかつ決定的に原始的な脊椎動物の造血を勉強するための効率的で効果的かつ安価なモデルとなっています。高速で安価なといくつかの技術的な困難の試金の世代は、小分子をテスト、突然変異体の胚を分析、HSPC 生物学の重要な分子経路の解明に利用できます。体外メッキ HSPCs のアダルト ゼブラフィッシュからは突然変異誘発、サイトカイン、造血?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
国立衛生研究所によって提供された資金 (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S. に)、バイオ テクノロジーにおける教育研究のカリフォルニア州立大学プログラム (CSUPERB: D.L.S. 脊椎動物の造血ニッチの分子制御)大学院の研究室 (A.C.B.)、カリフォルニア州立大学チコ校でから。
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
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