عزل وزراعة المتكفل العصبية تليها الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن من هستون 3 يسين 79 مارك ديميثيليشن
Summary
نحن نقدم طريقة فعالة واستنساخه لعزل وثقافة الخلايا العصبية السلف من الأنسجة الجنينية والولادة في الدماغ إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من هستون 3 يسين 79 ديميثيليشن (H3K79me2)–علامة هيستون تقع داخل مجال كروي من هستون 3.
Abstract
نمو الدماغ هو عملية معقدة، التي يسيطر عليها التدرجات مورفوجينس والبرامج النسخي المختلفة بطريقة الصدغي مكانية. بالإضافة إلى ذلك، تعديلات جينية الكروماتين، مثل مثلايشن هستون، دوراً هاما لإنشاء والحفاظ على مصائر الخلية المحددة في إطار هذه العملية. تحدث الغالبية العظمى من هيستون مثلايشن على ذيل مرنة هستون، الذي الوصول إلى معدلات هستون، ومحايات والبروتينات هستون القارئ. وفي المقابل، مثلايشن H3K79 يقع في مجال كروي من هستون 3 والمتورطة في المهام الإنمائية المختلفة. مثلايشن H3K79 هي تقحم المصانة ويمكن أن تكون وجدت في طائفة واسعة من الأنواع من الإنسان العاقل إلى Saccharomyces cerevisiae. حدث التعديل في خلية مختلفة السكان داخل الكائنات الحية، بما في ذلك فروعه العصبية. موقع مثلايشن H3K79 في مجال كروي من هستون 3 يجعل من الصعب تقييم. هنا، فإننا نقدم طرق لعزل والثقافة القشرية السلف الخلايا (Cpc) من الأنسجة الجنينية الدماغ القشرية (E11.5-E14.5) أو فروعه الدماغ العصبية الحبيبية (كجنبس) من الأنسجة بعد الولادة (P5-P7)، وإلى كفاءة إيمونوبريسيبيتاتي H3K79me2 PCR الكمي (qPCR) وتسلسل الجينوم على نطاق المنظومة.
Introduction
الوظائف الحسية والحركية والإدراكية للدماغ معقدة للغاية وعرضه للتغيرات المادية والبيئية. يتكون الدماغ من ثلاثة أجزاء عامة هند-، منتصف، وفوريبرين، التي ترتبط عميق. ضمن forebrain، يمكن تقسيم تيلينسيفالون تيلينسيفالون الظهرية (DT) وتيلينسيفالون البطني (فاتو). DT الفئران يتكون من ست طبقات القشرية التي تتشكل بين E11.5 و E18.5 بطريقة “من الداخل إلى الخارج”1. ويشمل فاتو امينينسيس جانجليونيك في التنمية، التي تشكل في وقت لاحق2،ganglia القاعدية3. ويمكن تصنيف في الثدييات الجهاز العصبي المركزي مثل الخلايا العصبية، أستروسيتيس، أو أوليجوديندروسيتيس4، الذي وضع في طريقة الصدغي مكانية5العديد من أنواع الخلايا. أولاً، تثير الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية، إينتيرنيورونس في فاتو، وإسقاط الخلايا العصبية في ديناراً، وفي وقت لاحق إلى الخلايا الدبقية (مثلاً، أستروسيتيس6). خلال التنمية القشرية، والطبقة الأكثر سطحية (طبقة أنا)، الذي يحتوي على خلايا ريتزيوس كيال، تتشكل أولاً. ثم، بين E12.5 و E14.5، تولد الشخصيات العصبية طبقات أعمق (الخامس والسادس) بينما بين 14.5 و 16.5، المتكفل تؤدي إلى الطبقة العليا (رابعا-ثانيا) من الخلايا العصبية7،8. يتم تحديد هوية الخلايا العصبية التي يسببها مورفوجين الصدغي المكانية النسخي البرامج المختلفة وبرامج جينية2بالإضافة إلى ذلك.
يقع في هيندبرين المخيخ، الذي تورط في التنسيق الحركي، وتطور بين E10 وتقريبا P20 في الفئران9. أنه يحتوي على قشرة الدماغ و نوى الدماغ10. قشرة الدماغ الكبار يتكون من ثلاث طبقات والطبقة الجزيئية الأبعد، طبقة خلايا بوركنجي والطبقة الحبيبية الأعمق التي تحتوي على الخلايا العصبية محبب10. الخلايا الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية أصغر وتمثل حوالي 80 في المائة من جميع الخلايا العصبية في الدماغ الفقاريات11. وضع من السلائف التي تقع في منطقة جيرمنال الخارجية والهجرة من خلال طبقة خلايا بوركنجي إلى تلك الوجهة12. مثل ينظم وضع المخيخ في telencephalon، مورفوجينس مهمة عدة، التي لها وظائف محددة الوقت والفضاء التابعة والشروع في تعريف برامج النسخي10.
يتم التحكم في وضع الطبقات القشرية والدماغ النسخي التعبير عن مورفوجينس محددة، ومن ثم الدولة الكروماتين للحمض النووي. في طريقة عرض مبسط، يمكن تقسيم الدول الكروماتين euchromatin كنشاط ترانسكريبتيونالي وهيتيروتشروماتين كمناطق صامتة ترانسكريبتيونالي. نوكليوسومي كوحدة أساسية من الكروماتين يحتوي على نسختين من كل هيستون الأساسية H2A، H2B و H3 و H4، محاطة بزوج قاعدي 147 من الحمض الخلوي الصبغي13. يتم تعديل هيستونيس عالية بوستترانسلاتيونالي مثلايشن acetylation، الفسفرة، أوبيكويتينيشن، سومويليشن، ريبوسيليشن ADP، deamination وبرولين isomerization14،15. يعتبر مثلايشن يسين هستون تعديل هيستون الأكثر استقرارا التي تتحكم في النسخ والنسخ المتماثل وممارسو16، تلف الحمض النووي استجابة17وطابعه الجينوم18. ويمكن ليسينيس مونو-دي-أو ثلاثي ميثليته19 وتظهر ليس فقط في ذيول هيستون موجوداً ولكن أيضا داخل نطاق كروي histones20. ميثيليشنز المحددة في H3K4 و H3K36 ترتبط أساسا يوتشروماتين، ميثيليشنز محددة في H3K9، أو H3K27، أو H4K20 توجد أساسا في مناطق heterochromatic، على الرغم من أن جميع مخلفات تقع داخل الذيل هيستون14، 19،21. مثلايشن H3K79 يقع ضمن مجال كروي هيستون وارتبطت بنشاط النسخي، بل أيضا مع مناطق الجينوم خاملة ترانسكريبتيونالي22. هي تقحم حفظت التعديل نظراً لأنه قد لوحظ في الخميرة والغدة الصعترية العجل والدجاج و الإنسان23. H3K79 مونو ودي تريميثيليشن (H3K79me1، me2، me3) هي تحفزها هيستون ميثيلترانسفيراسيس DOT1L24،25 و النووية مجموعة المجال التي تحتوي على بروتين 2 (Nsd2)26. DOT1L المتورطة في الانتشار وإصلاح الحمض النووي الخلوي ريبروجرامينج27. فقدان Dot1l في الفئران يؤدي إلى وفاة قبل الولادة حوالي28،E10.5 المرحلة الإنمائية29. أثناء تطوير القلب والتمايز ميوكارديوسيتي، DOT1L ضروري ل تنظيم التعبير الجيني30. في الجهاز العصبي المركزي، وقد تورط الدالة DOT1L في الأنبوب العصبي التنمية31، وهي تشارك في قمع Tbr1-التعبير خلال forebrain التنمية32، وقد تعمل في تنظيم ER-الإجهاد استجابة الجينات33. تعتمد على سياق تنشيط أو عمل تقطعون من H3K79me، لا سيما مع حالات في فيفو مثل تطوير الجهاز العصبي المركزي، التاريخ فقط يفهم جزئيا32. منذ مثلايشن H3K79 يقع في مجال كروي من هستون 3، أنها ستيريكالي الوصول إليها أقل بالمقارنة مع تعديلات في ذيول هيستون مرنة23. هناك حاجة لفهم وظيفة مثلايشن H3K79، أساليب تحليل موثوق واستنساخه لتحديد موقعها وبيئة الجينوم. نقدم في هذه الورقة، وأساليب طرق عزل مختلف فروعه العصبية (Cpc للقشرة) وكجنبس المخيخ والعلاج مثبطات DOT1L الفعال وأسلوب رقاقة لتحليل مثلايشن H3K79 عن طريق قبكر أو التسلسل في وقت مختلف النقاط خلال التنمية القشرية والدماغ. لإلقاء نظرة عامة على البروتوكول وإمكانياتها، انظر الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك طريقتان الرئيسي لأداء إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للكشف عن الجينوم شغل التعديلات هستون، عوامل النسخ، هستون رمز القراء، والكتاب، أو ومحايات. واحد هو الأسلوب رقاقة الأصلي باستخدام nuclease هضمها، الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن، والآخر هو أن أسلوب عرضها باستخدام الكروماتين ثاب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر هنرييت بيرتيميس للمساعدة على إنشاء البروتوكول زراعة CGN داخل المختبر. وأيد هذه الورقة أسلوب “التخلق الطبية” الممولة من DFG CRC992 بتمويل للتلفزيون. يعترف الكتاب الدعم من “فريق غالاكسي فرايبورغ”: فيديم بافانكومار، بيورن Grüning، والبروفيسور رولف باكوفين، المعلوماتية الحيوية، جامعة فرايبورغ، ألمانيا تمول “التعاونية أبحاث المركز 992 الطبية اللاجيني” (منحة DFG SFB 2012 992/1) والوزارة الألمانية الاتحادية للتعليم والبحوث (الفدرالية منحة 031 A538A ربك (دي. مبادرة حوض النيل)).
Materials
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium | |||
References
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
- Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
- Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
- Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
- Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
- McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
- Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
- Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
- Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
- Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
- Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
- Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
- Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
- van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
- Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
- Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
- Roidl, D. . Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
- Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).
