Изоляция и культивирование нервных прародителей, следуют иммунопреципитации Chromatin гистона 3 лизина 79 Dimethylation марки

Чувств, мотор и когнитивных функций мозга являются весьма сложными и подвержены физическим и экологических изменений. Мозг состоит из трех основных частей Хинд-, средне-и переднего мозга, которые глубоко связаны. В рамках переднего конечного мозга можно разделить на спинной конечного мозга (DT) и брюшной конечного мозга (VT). DT мышей состоит из шести корковых слоев, которые формируются между E11.5 и E18.5 в форме «наизнанку»¹. ЖТЛ включает Ганглиозный Высокопреосвященства в развитии, которые впоследствии образуют базальных ганглиев^2,3. Несколько типов клеток могут быть классифицированы в млекопитающих центральной нервной системы, таких как нейроны, астроциты или⁴олигодендроциты, которые развиваются в височно пространственной способом⁵. Во-первых нейронные прогениторных клеток (НПС) порождают различные виды нейронов, интернейронов и VT, проекции нейронов в DT, а позднее на глиальных клеток (например, астроциты⁶). Во время разработки коры головного мозга, наиболее поверхностный слой (уровень I), который содержит клетки Кахаля-Ретциуса, формируется сначала. Затем между E12.5 и E14.5, НПС генерировать глубже нейрональных слоёв (VI, V) во время между 14,5 и 16,5, прародители порождают верхний слой (IV-II) нейронов^7,8. Нейрональных личность задается путем различных morphogen индуцированной височно пространственной транскрипционный анализ программ и дополнительно эпигеномные программы².

Мозжечка, который подразумевается в двигательной координации, расположен в задний мозг и развивается между E10 и около P20 в мышей⁹. Он содержит коры мозжечка и мозжечковая ядер¹⁰. Взрослый коры мозжечка состоит из трех слоев, внешний молекулярный слой, слоя клеток Пуркинье и внутренний зернистый слой, содержащий гранулированных нейронов¹⁰. Мозжечковая гранул клетки наименьшее нейронов и составляют около 80% всех нейронов мозга позвоночных¹¹. Они развиваются из прекурсоров, расположенных в зоне внешней зародышевого и мигрируют через слой клеток Пуркинье, чтобы их назначения¹². Как в конечного мозга, развитие мозжечка регулируется несколько важных morphogens, которые имеют конкретные и пространства зависящие от времени функций и инициировать определенные транскрипционный анализ программы¹⁰.

Разработка слои коры и верхней мозжечковой контролируется transcriptional выражением конкретных morphogens и, таким образом, состояние хроматина ДНК. В упрощенном режиме хроматина государства можно разделить на euchromatin как транскрипционно активная и гетерохроматин как транскрипционно немого регионов. Нуклеосома как основной ячейкой хроматина содержит две копии каждого ядра гистона H2A, H2B, H3 и H4, окруженный 147 пар оснований ДНК¹³. Высоко post-translationally гистонами изменяются путем метилирования, ацетилирования, фосфорилирование, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, дезаминирование и пролина изомеризации^14,15. Лизин метилирование гистонов считается наиболее стабильных гистона модификация, которая контролирует транскрипции, репликации, рекомбинация¹⁶, повреждение ДНК ответ¹⁷и геномный импринтинг¹⁸. Lysines может быть моно-, ди-или tri метилированную¹⁹ и появляются не только на доступные гистона хвосты, но и внутри шаровидных домена гистонами²⁰. Конкретные methylations H3K4 и H3K36 в основном связаны с euchromatin, конкретных methylations в H3K9, H3K27 или H4K20 главным образом найдены в гетерохроматиновых, хотя все остатки расположены в пределах гистона хвост^{14, 19,21}. H3K79 метилирование расположен в пределах домена шаровидных гистона и был связан с транскрипционный анализ активности, но и с транскрипционно инертных регионах геномной²². Модификация эволюционно сохраняется так, как было отмечено в дрожжи, вилочковой железы теленка, курица и человека²³. H3K79 моно, ди и trimethylation (H3K79me1, me2, me3) катализируемые гистона methyltransferases DOT1L^24,25 и ядерных SET домен-содержащих белков 2 (Nsd2)²⁶. DOT1L причастен к распространению, репарации ДНК и сотовых перепрограммирования²⁷. Потеря Dot1l в мышах приводит к пренатальной смерти вокруг^28,E10.5 стадии развития²⁹. Во время разработки сердца и myocardiocyte дифференциации DOT1L имеет важное значение для ген выражение правила³⁰. В центральной нервной системе, DOT1L функция может быть причастны развития нервной трубки³¹, он участвует в подавлении Tbr1-выражение во время развития переднего³²и может функционировать в регулировании ER-стресс ответ генов³³. Контекстно зависимые активации или подавления действий H3K79me, особенно с в естественных условиях ситуаций, как развитие центральной нервной системы, является на сегодняшний день только частично понял³². Так как H3K79 метилирование расположен в шаровых области гистона 3, он доступен труднодоступных меньше по сравнению с изменения на гибкой гистона хвосты²³. Чтобы понять функцию H3K79 метилирование, необходимы методы анализа надежных и воспроизводимых для определения его местоположения и геномная окружающей среды. В этом документе методы мы представляем методы изоляции различных нейронных прародителями (CPC для коры) и CGNPs для мозжечка, эффективное лечение ингибитором DOT1L, и чип метода для анализа метилирования H3K79 через ПЦР или последовательности в разное время очков во время разработки корковых и мозжечка. Обзор протокола и его возможности смотрите Рисунок 1.