Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

Le funzioni sensoriali, motorie e cognitive del cervello sono estremamente complessi e sensibili ai cambiamenti fisici ed ambientali. Il cervello è costituito da tre parti generali hind-, mid-e del forebrain, che sono profondamente collegati. All’interno del forebrain, telencefalo può essere diviso in un telencefalo dorsale (DT) e un ventrale telencefalo (VT). Il DT dei topi è costituito da sei strati corticali che si formano tra E11.5 ed E18.5 in un modo “inside-out”¹. Il VT comprende le eminenze gangliare in sviluppo, che poi formano i gangli basali^2,3. Diversi tipi di cellule possono essere classificati nel sistema nervoso centrale dei mammiferi quali neuroni, astrociti e oligodendrociti⁴, che si sviluppano in un modo temporo-spaziale⁵. In primo luogo, le cellule progenitrici neurali (NPC) danno origine a diversi tipi di neuroni, interneuroni nel VT e neuroni di proiezione nella DT e successivamente ai cellule gliali (ad es., gli astrociti⁶). Durante lo sviluppo corticale, lo strato più superficiale (strato I), che contiene le cellule di Cajal-Retzius, si forma dapprima. Quindi, tra 12.5 ed e 14.5, NPC generano più profondi strati neuronali (VI, V) mentre tra 14,5 e 16,5, progenitori danno origine al livello superiore (IV-II) neuroni^7,8. Un neurone identità viene specificata da diversi programmi di transcriptional temporo-spaziale indotta da morfogeno e inoltre da epigenetici programmi².

Il cervelletto, che è implicato nella coordinazione motoria, si trova del hindbrain e si sviluppa tra E10 e approssimativamente P20 in topi⁹. Esso contiene la corteccia cerebellare ed i nuclei cerebellari¹⁰. La corteccia cerebellare adulta è costituito da tre strati, lo strato molecolare più esterno, lo strato delle cellule di Purkinje e lo strato granulare più interno che contiene neuroni granulari¹⁰. Le cellule cerebellari del granello sono i neuroni più piccoli e rappresentano circa l’80% di tutti i neuroni nel cervello dei vertebrati¹¹. Sviluppano da precursori che si trova nella zona germinale esterna e migrano attraverso lo strato di cellule di Purkinje al loro destinazione¹². Come nel telencefalo, lo sviluppo del cervelletto è regolato da diversi importanti morfogeni, che hanno funzioni specifiche e spazio-temporale e avviare definiti programmi trascrizionali¹⁰.

Lo sviluppo degli strati corticali e cerebellari è controllato dall’espressione trascrizionale di specifici morfogeni e, quindi, dallo stato della cromatina del DNA. In una vista semplificata, gli Stati della cromatina è divisibile in euchromatin come trascrizionalmente attiva e l’eterocromatina come regioni transcriptionally silenziose. Il nucleosoma come unità di base della cromatina contiene due copie di ogni istone core H2A, H2B, H3 e H4, circondato da 147 paia di basi di DNA¹³. Gli istoni sono altamente traduzionalmente modificati di metilazione, acetilazione, fosforilazione, ubiquitinazione, sumoilazione, ADP-ribosylation, deaminazione e prolina isomerizzazione^14,15. Metilazione dell’istone lisina è considerata il più stabile modifica dell’istone che controlla la trascrizione, replica, ricombinazione¹⁶, DNA-danno risposta¹⁷e imprinting genomico¹⁸. Lisine possono essere mono-, di- o tri-metilato¹⁹ e appaiono non solo sulle code degli istoni accessibile, ma anche all’interno del dominio globulare di istoni²⁰. Iperomocisteinemici specifici alle H3K4 e H3K36 sono associate principalmente l’eucromatina, specifici iperomocisteinemici H3K9, H3K27 o H4K20 si trovano principalmente in regioni eterocromatiche, anche se tutti i residui sono situati entro l’istone coda^{14, 19,21}. La metilazione di H3K79 si trova all’interno del dominio globulare istone ed è stata associata con l’attività trascrizionale, ma anche con regioni genomiche trascrizionalmente inerte²². La modifica è evolutivamente conservata poiché è stato osservato in lievito, timo di vitello, pollo e umano²³. H3K79 mono, di e trimethylation (H3K79me1, me2, me3) sono catalizzate dalle istone metiltransferasi DOT1L^24,25 e il nucleare SET dominio-contenente della proteina 2 (Nsd2)²⁶. DOT1L è implicato nella proliferazione e riparazione del DNA cellulare riprogrammazione²⁷. Perdita di Dot1l in topi porta ad una morte prenatale intorno la fase inerente allo sviluppo e 10.5^28,29. Durante lo sviluppo del cuore e nella differenziazione dei myocardiocyte, DOT1L è essenziale per gene espressione regolamento³⁰. Nel sistema nervoso centrale, DOT1L funzione potrebbe essere implicato nel tubo neurale sviluppo³¹, è coinvolto nella soppressione Tbr1-espressione nel proencefalo sviluppo³²e potrebbe funzionare nella regolazione di sforzo di ER geni di risposta³³. Il contesto-dipendente attivando o reprimere azione di H3K79me, soprattutto con situazioni in vivo come lo sviluppo del sistema nervoso centrale, è ad oggi solo parzialmente capito³². Poiché H3K79 metilazione si trova nel dominio globulare dell’istone 3, è stericamente meno accessibile rispetto alle modifiche sui code istoniche flessibile²³. Per comprendere la funzione di metilazione di H3K79, sono necessari metodi di analisi affidabili e riproducibili per determinare la sua posizione e ambiente genomica. In questa carta di metodi, presentiamo metodi di isolamento di diversi progenitori neurali (CPC per la corteccia) e CGNPs per il cervelletto, efficace trattamento dell’inibitore di DOT1L e un metodo di ChIP per analizzare la metilazione H3K79 via qPCR o sequenziamento in tempi diversi punti durante lo sviluppo corticale e cerebellare. Per una panoramica del protocollo e delle sue possibilità, Vedi Figura 1.