Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

Les fonctions sensorielles, motrices et cognitives du cerveau sont très complexes et sensibles aux changements physiques et environnementaux. Le cerveau est constitué de trois parties générales le hind-, moyennes et du cerveau, qui sont profondément liées. Dans le cerveau antérieur, le télencéphale se divisent en une dorsale télencéphale (DT) et un télencéphale ventral (VT). La DT de souris se compose de six couches corticales qui sont forment entre E11.5 et E18.5 dans une façon de « inside-out »¹. Le VT comprend les éminences ganglionnaires dans le développement, qui forment plus tard les ganglions de la base^2,3. Plusieurs types de cellules peuvent être classés dans le système nerveux central chez les mammifères tels que les neurones, astrocytes, oligodendrocytes⁴ou qui se développent dans une manière temporo-spatiale⁵. Tout d’abord, les cellules progénitrices neurales (PNJ) donnent lieu à différents types de neurones, les interneurones dans le VT et des neurones de projection dans la DT et plus tard sur les cellules gliales (p. ex., les astrocytes,⁶). Au cours du développement cortical, couche la plus superficielle (couche I), qui contient des cellules de Cajal-Retzius, est formé en premier. Puis, entre E12.5 et E14.5, PNJs génèrent des plus profondes couches neuronales (VI, V) tandis qu’entre 14,5 et 16.5, progéniteurs donnent lieu à des neurones de la couche supérieure (IV-II)^7,8. Aucune identité neuronale est spécifié par différents programmes temporo-spatiale transcriptionnelles induite sur les capacités et en outre par l’épigénétique programmes².

Le cervelet, qui est impliqué dans la coordination motrice, est situé dans le cerveau postérieur et se développe entre E10 et environ P20 souris⁹. Il contient le cortex cérébelleux et les noyaux cérébelleux¹⁰. Le cortex cérébelleux adult se compose de trois couches, la couche moléculaire, la couche de cellules de Purkinje et la couche granulaire interne contenant des neurones granulaires¹⁰. Les microglies cérébelleuses sont les plus petits neurones et représentent environ 80 % de tous les neurones dans le cerveau de vertébrés¹¹. Ils se développent à partir des précurseurs situés dans la zone externe de germinale et migrent à travers la couche de cellules de Purkinje à leur destination¹². Comme dans le télencéphale, le développement du cervelet est régi par plusieurs morphogènes importants, qui ont des fonctions spécifique et espace-dépendant du temps et initier défini transcriptionnelle programmes¹⁰.

Le développement des couches corticales et cérébelleux est contrôlé par l’expression transcriptionnelle de morphogènes spécifiques et, ainsi, par l’état de la chromatine de l’ADN. Dans une vue simplifiée, les États de la chromatine se divisent en euchromatine comme activité de transcription et hétérochromatine comme régions transcriptionally silencieuses. Le nucléosome est l’unité fondamentale de la chromatine contient deux copies de chaque histone core H2A, H2B, H3 et H4, entouré de 147 paires de bases d’ADN¹³. Les histones sont hautement post-traductionnellement modifiées par méthylation, acétylation, phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, désamination et proline isomérisation^14,15. Méthylation de lysine histone est réputée être la modification d’histone plus stable qui contrôle la transcription, réplication, recombinaison¹⁶, dommages à l’ADN réponse¹⁷et l’empreinte génomique¹⁸. Lysines peuvent être mono-, di- ou tri-méthylés¹⁹ et apparaissent non seulement sur les queues d’histone accessible, mais aussi au sein du domaine globulaire d’histones²⁰. Les méthylations spécifiques à H3K4 et H3K36 sont principalement liées à l’euchromatine, méthylations spécifiques au H3K9, H3K27 ou H4K20 se trouvent principalement dans des régions hétérochromatiques, bien que tous les résidus sont situés au sein de l’histone Queue^{14, 19,},²¹. Méthylation de l’H3K79 est située dans le domaine globulaire histone et a été associée à l’activité transcriptionnelle, mais aussi avec les régions génomiques transcriptionnellement inerte²². La modification est conservée évolutif puisqu’il a été observé chez la levure, thymus de veau, poulet et humaine²³. H3K79 mono, di et triméthylation (H3K79me1, me2, me3) sont catalysées par l’histone methyltransferases DOT1L^24,25 et le nucléaire SET contenant du domaine Protein 2 (Nsd2)²⁶. DOT1L est impliqué dans la prolifération et réparation de l’ADN cellulaire reprogrammation²⁷. Perte de Dot1l chez la souris entraîne un décès prénatal autour du stade de développement de^28,E10.5²⁹. Au cours du développement du cœur et dans la différenciation myocardiocyte, DOT1L est essentiel pour gene expression règlement³⁰. Dans le système nerveux central, DOT1L fonction pourrait être impliquée dans le tube neural development³¹, il est impliqué dans la répression des Tbr1-expression lors du prosencéphale développement³²et peuvent fonctionner dans la régulation du stress du re gènes de réponse³³. L’activation dépendante du contexte ou la répression action de H3K79me, en particulier avec in vivo des situations comme le développement du système nerveux central, est à ce jour, seulement partiellement compris³². Méthylation de l’H3K79 se trouve dans le domaine globulaire de l’histone 3, il est stériquement moins accessible par rapport à des modifications sur l’histone flexible queues²³. Pour comprendre la fonction de méthylation de l’H3K79, des méthodes d’analyse fiables et reproductibles pour déterminer son emplacement et son environnement génomique sont nécessaires. Dans cet article des méthodes, nous présentons des méthodes d’isolation des différentes progéniteurs neurones (CPC pour le cortex) et CGNPs pour le cervelet, un traitement inhibiteur de la DOT1L efficace et une méthode de puce pour analyser H3K79 méthylation par qPCR ou séquençage en temps différents points au cours du développement cortical et cérébelleux. Pour une vue d’ensemble du protocole et de ses possibilités, voir la Figure 1.