Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

De sensorische, motorische en cognitieve functies van de hersenen zijn zeer complex en gevoelig voor fysieke en ecologische veranderingen. De hersenen bestaat uit drie algemene delen de hind-, midden-, en reukkolf, die diep met elkaar zijn verbonden. Binnen de reukkolf, kan de telencephalon worden onderverdeeld in een dorsale telencephalon (DT) en een ventrale telencephalon (VT). De DT van muizen bestaat uit zes corticale lagen die worden gevormd tussen E11.5 en E18.5 in een “binnenstebuiten” manier¹. De VT bevat de ganglionaire eminenties in ontwikkeling, die later het vormen van de basale ganglia^2,3. Verschillende soorten cellen kunnen worden ingedeeld in de zoogdieren centrale zenuwstelsel zoals neuronen, astrocyten, oligodendrocyten⁴, of die zich in een temporo-ruimtelijke wijze^{5 ontwikkelen}. Ten eerste, de neurale voorlopercellen (NPC) aanleiding geven tot verschillende soorten neuronen, interneuronen in de VT en projectie neuronen in het DT, en later naar gliale cellen (bijvoorbeeld, astrocyten⁶). Tijdens de corticale ontwikkeling, de meest oppervlakkige laag (layer ik), die bevat Cajal-Retzius cellen, eerst wordt gevormd. Vervolgens, tussen E12.5 en E14.5, NPC’s genereren diepere neuronale lagen (VI, V) terwijl tussen 14,5 en 16,5, progenitoren aanleiding geven tot^7,8van de neuronen van de bovenste laag (IV-II). Neuronale identiteit is opgegeven door de verschillende morphogen-geïnduceerde temporo-ruimtelijke transcriptionele programma’s, en daarnaast door epigenetische programma’s².

Het cerebellum, die is betrokken bij de coördinatie van de motor, is gelegen in de hindbrain en ontwikkelt tussen E10 en ongeveer P20 in muizen⁹. Het bevat de cerebellaire cortex en de cerebellaire kernen¹⁰. De volwassen cerebellaire cortex bestaat uit drie lagen, de buitenste laag van de moleculaire, het Purkinje cellaag en de binnenste granulaire laag met granulaire neuronen¹⁰. De cerebellaire submodule cellen zijn de kleinste neuronen en vertegenwoordigen ongeveer 80% van alle neuronen in de hersenen van de gewervelde¹¹. Ze migreren door het Purkinje cellaag naar hun bestemming¹²en ontwikkelen van precursoren in de externe germinal zone bevindt. Zoals in de telencephalon, de ontwikkeling van het cerebellum wordt geregeld door verschillende belangrijke morphogens, die hebben specifieke tijd – en ruimte-afhankelijke functies en initiëren gedefinieerd transcriptionele programma’s¹⁰.

De ontwikkeling van corticale en cerebellaire lagen wordt gecontroleerd door transcriptionele expressie van specifieke morphogens en, dus, door de staat van de chromatine van het DNA. In een vereenvoudigde weergave, kunnen chromatine-Staten worden onderverdeeld in euchromatine als transcriptionally actief en heterochromatin als transcriptionally stille gebieden. De nucleosoom als de basiseenheid van de chromatine bevat twee kopieën van elke kern Histon H2A, H2B, H3 en H4, omringd door 147 basenparen van DNA¹³. Histonen zijn zeer post-translationally gewijzigd door methylering, acetylation, fosforylatie, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, deamination en proline isomerisatie^14,15. Histon lysine methylering wordt beschouwd als de meest stabiele Histon wijziging die transcriptie, replicatie, recombinatie¹⁶, DNA-schade antwoord¹⁷en genomische inprenting^{18 besturingselementen}. Lysines worden mono-, di- en tri-gemethyleerd¹⁹ en verschijnen niet alleen op de staarten toegankelijk Histon, maar ook binnen het bolvormige domein van histones²⁰. Specifieke methyleringen op H3K4 en H3K36 worden vooral geassocieerd met euchromatine, specifieke methyleringen op H3K9, H3K27 of H4K20 zijn voornamelijk te vinden in de hétérochromatique regio’s, hoewel alle residuen bevinden zich binnen de Histon staart^{14, 19,21}. Methylation van H3K79 is bevindt zich in het bolvormige domein van Histon en geassocieerd met een transcriptionele activiteit, maar ook met transcriptionally inerte genomic regio²². De wijziging is evolutionair bewaard aangezien geconstateerd in gist, kalf zwezerik, kip en menselijke²³. H3K79 mono-, di- en trimethylation (H3K79me1, me2, me3) worden gekatalyseerd door de Histon methyltransferases DOT1L^24,25 en de nucleaire SET Domain-bevattende eiwitten 2 (Nsd2)²⁶. DOT1L is betrokken bij de proliferatie, DNA-reparatie en mobiele reprograming²⁷. Verlies van Dot1l in muizen leidt tot een prenatale dood rond de ontwikkelingsstadium E10.5^28,29. Tijdens de ontwikkeling van het hart en bij myocardiocyte differentiatie is DOT1L essentieel voor gen expressie verordening³⁰. In het centrale zenuwstelsel, DOT1L functie kan worden betrokken bij de neurale buis ontwikkeling³¹, het is betrokken bij het onderdrukken van Tbr1-expressie tijdens reukkolf ontwikkeling³², en kan functioneren in de regulering van ER-stress reactie genen³³. De context-afhankelijke activeren of de actie van de bestrijding van H3K79me, vooral met in vivo situaties zoals de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel, is tot nu toe slechts gedeeltelijk begrepen³². Aangezien H3K79 methylering zich in het bolvormige gebied van Histon 3 bevindt, is het sterically minder toegankelijk in vergelijking met wijzigingen op de flexibele Histon staarten²³. Om te begrijpen van de functie van H3K79 methylering, zijn betrouwbare en reproduceerbare analysemethoden ter bepaling van de locatie en de genomische omgeving nodig. In deze paper methoden presenteren wij isolatie methoden van verschillende neurale progenitoren (CPC voor de cortex) en CGNPs voor het cerebellum, effectieve DOT1L remmer behandeling en een ChIP-methode voor het analyseren van methylation van H3K79 via qPCR of rangschikken op ander moment punten tijdens corticale en Cerebellaire ontwikkeling. Voor een overzicht van het protocol en de mogelijkheden, Zie Figuur 1.