Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Die sensorischen, motorischen und kognitiven Funktionen des Gehirns sind hoch komplex und anfällig für körperliche und ökologischen Veränderungen. Das Gehirn besteht aus drei allgemeine Teile der Hind-, Mittel-, und Vorderhirn, die zutiefst verbunden sind. Im Vorderhirn kann das Telencephalon in einer dorsalen Telenzephalon (DT) und einer ventralen Telencephalon (VT) unterteilt werden. Die DT von Mäusen besteht aus sechs kortikalen Schichten, die zwischen E11.5 und E18.5 in einer Art und Weise der “Inside-Out”¹gebildet werden. Der VT umfasst die ganglionic Eminenzen in Entwicklung, die später die Basalganglien^2,3bilden. Verschiedene Zelltypen lassen sich einteilen in den Säugetier-Zentralnervensystem wie Neuronen, Astrozyten oder Oligodendrozyten⁴, die in einem Temporo-räumliche Weise⁵zu entwickeln. Zunächst entstehen die neurale Vorläuferzellen (NPCs) verschiedene Arten von Neuronen, Interneuronen in der VT und Projektion Neuronen in der DT und später nach Gliazellen (z.B. Astrozyten⁶). Während der kortikalen Entwicklung, die oberflächlichste Schicht (Schicht I), Cajal-Retzius-Zellen enthält zuerst gebildet ist. Anschließend generieren NPCs zwischen E12.5 und E14.5, neuronale Tiefenschichten (VI, V) beim zwischen 14,5 und 16,5, Stammväter Anlass zu Oberschicht (IV-II) Neuronen^7,8. Neuronale Identität wird von verschiedenen Morphogen-induzierte Temporo-räumliche transkriptionelle Programmen und zusätzlich durch epigenetische Programme²angegeben.

Das Kleinhirn, die motorische Koordination beteiligt ist, befindet sich in dem Hinterhirn und zwischen E10 und grob P20 in Mäusen⁹entwickelt. Es enthält die zerebelläre Kortex und zerebelläre Kerne¹⁰. Die Erwachsenen zerebelläre Kortex besteht aus drei Schichten, die äußerste molekulare Schicht, die Purkinje-Zellschicht und der innersten Körnerschicht enthält körnige Neuronen¹⁰. Die zerebelläre Granulat-Zellen sind die kleinsten Neuronen und repräsentieren rund 80 % aller Neuronen in der vertebrate Gehirn-¹¹. Sie entwickeln aus Vorstufen in der externen germinal Zone gelegen und durchwandern der Purkinje Zelle Schicht auf ihre Ziel-¹². Wie die Entwicklung des Kleinhirns im Telencephalon, durch mehrere wichtige Morphogens reguliert wird, definiert die bestimmte Zeit und Raum-abhängige Funktionen und initiieren transkriptionelle Programme¹⁰.

Die Entwicklung der kortikalen und zerebelläre Schichten wird durch transkriptionelle Ausdruck der spezifischen Morphogens und damit der Chromatin-Staat der DNA gesteuert. In einer vereinfachten Ansicht können Euchromatin als transcriptionally aktiv und Heterochromatin als transcriptionally leisen Regionen Chromatin Staaten aufgeteilt werden. Das Nukleosom als die grundlegende Maßeinheit des Chromatins enthält zwei Kopien von jedem Core-Histone H2A, H2B, H3 und H4, umgeben von 147 Basenpaare der DNA-¹³. Histone werden durch Methylierung, Acetylierung Phosphorylierung, Ubiquitination, Sumoylierung, ADP-Ribosylation, Deamination und Prolin Isomerisierung^14,15hoch posttranslational modifiziert. Histon-Lysin-Methylierung gilt als die stabilste Histon-Modifikation, die Transkription, Replikation, Rekombination¹⁶, DNA-Schäden Antwort¹⁷und genomische Prägung¹⁸steuert. Lysines können Mono-, di- oder Tri-methylierte¹⁹ und erscheinen nicht nur auf den zugänglichen Histon-Schwänzen, sondern auch innerhalb der globulären Domäne der Histone²⁰. Spezifische Methylations H3K4 und H3K36 vor allem mit Euchromatin verbunden sind, spezifische Methylations bei H3K9, H3K27 oder H4K20 sind vor allem in heterochromatischen Regionen gefunden, obwohl alle Rückstände der Histon Schweif^14, liegen ^19,21. H3K79-Methylierung befindet sich innerhalb der Histon globulären Domäne und transkriptionelle Aktivität, sondern auch mit transcriptionally inert genomische Regionen²²zugeordnet wurde. Die Änderung ist evolutionär konserviert, da es in Hefe, Thymus Kalb, Huhn und menschlichen²³beobachtet hat. H3K79 Mono, di und Trimethylation (H3K79me1, me2, me3) sind durch die Histon-Methyltransferasen DOT1L^24,25 und die nukleare SET Domain-haltige Protein 2 (Nsd2)²⁶katalysiert. DOT1L ist in Proliferation, DNA-Reparatur und Mobilfunk umprogrammieren²⁷verwickelt. Verlust von Dot1l bei Mäusen führt zu einer pränatalen Tod um die Entwicklungsphase E10.5^28,29. Während der Entwicklung von Herz und Myocardiocyte Differenzierung unbedingt DOT1L gen Ausdruck Verordnung³⁰. In das zentrale Nervensystem, DOT1L Funktion im Neuralrohr Entwicklung³¹einbezogen werden könnte, sie engagiert sich bei der Unterdrückung der Tbr1-Ausdruck im Vorderhirn Entwicklung³², und funktionieren in der Verordnung von ER-Stress Antwort Gene³³. Die Kontext-abhängige Aktivierung oder unterdrücken Einwirkung von H3K79me, vor allem mit in Vivo Situationen wie die Entwicklung des zentralen Nervensystems, ist bis heute nur teilweise verstanden³². Da H3K79-Methylierung in der globulären Domäne von Histon 3 befindet, ist es im Vergleich zu Änderungen auf die flexible Histone Tails²³sterisch weniger zugänglich. Um die Funktion der H3K79-Methylierung zu verstehen, brauchen wir zuverlässige und reproduzierbare Analyse-Methoden, seine Lage und genomische Umwelt bestimmen. In diesem Methoden-Papier präsentieren wir Ihnen Isolationsmethoden von verschiedenen neuronalen Vorläuferzellen (CPC-Gebote für den Kortex) und CGNPs für das Kleinhirn, wirksame DOT1L Inhibitor Behandlung und eine ChIP-Methode H3K79 Methylierung mittels qPCR oder Sequenzierung zu verschiedener Zeit analysieren Punkte während der kortikalen und zerebelläre Entwicklung. Für einen Überblick über das Protokoll und seine Möglichkeiten siehe Abbildung 1.