Summary

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Published: January 05, 2018
doi:

Summary

Mitokondri bitki hücre sadece küçük bir yüzdesi olarak, onlar çalışmalar bir dizi için saf gerekir. Mitokondri bitki organları çeşitli Homojenizasyon, son derece saf mitokondriyal kesir elde etmek için Diferansiyel ve yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından takip tarafından ayrılmış olabilir.

Abstract

Mitokondri temel organelleri tesislerinde, en önemlisi adenozin trifosfat (ATP) oksidasyon Nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) ve flavin adenin gibi azaltılmış bileşiklerin üretimi çok sayıda metabolik yollar yer vardır dinükleotit (FADH2). Arabidopsis thaliana genomunun tam ek açıklama olarak en yaygın olarak kullanılan bitki modeli sistemi ve böylece mitokondri organları (yaprak, kök veya çiçek) çeşitli arındırmak gerek dolu araçları kullanmak için gerekli olan kurmuştur bu Artık Arabidopsis mitokondrial Biyoloji eğitim kullanılabilir. Mitokondri homojenizasyon yaklaşımlar, daha fazla sürekli kolloidal yoğunluk gradient kullanarak saf bir ham mitokondrial Pelet üreten fark Santrifüjü adımlar bir dizi tarafından takip çeşitli kullanarak doku tarafından izole Santrifüjü. Kolloidal yoğunluk malzeme daha sonra birden çok Santrifüjü adımı tarafından kaldırıldı. 100 g taze yaprak doku başlayarak, 2-3 mg mitokondri rutin olarak elde edilebilir. Bu mitokondri solunum deney 100-250 nmol O2 dk-1 mg toplam mitokondrial protein-1 (NADH bağımlı oranı) tipik oranları hangi belirlemek için çeşitli yüzeyler ve inhibitörleri kullanma yeteneği ile görüntüleme yüzeylerde okside ve alternatif ve sitokrom terminal oxidases kapasitesi. Bu iletişim kuralı mitokondri Arabidopsis thaliana yaprakları sürekli kolloidal yoğunluk gradyanlar ve arıtılmış bitki mitokondri verimli bir solunum ölçümleri kullanarak üzerinden bir yalıtım yöntemini açıklar.

Introduction

Bitki mitokondrial araştırma tarihinin 100 yıl1döner. Sağlam mitokondri ilk 1950’lerin başında izole fark Santrifüjü kullanarak. 1980’lerde kolloidal yoğunluğu Gradyanda gelişiyle mitokondri ozmotik ayarlama suffering olmadan saf izin. Degrade arıtılmış mitokondri kütle spektrometresi, duyarlılık nedeniyle çoğu amaç için uygun olmakla birlikte bile nispeten küçük kirletici maddeleri tespit edilebilir ve uygunsuz bir şekilde mitokondrial konumu2atanabilir. Plastidic her ikisi de kaldırmak kullanımı serbest akışını Elektroforez can ve akış peroxisome kirlenme3, ama özgür Elektroforez alanında son derece uzman bir teknik ve çalışmaları büyük çoğunluğu için gerekli değildir. Ayrıca, ne zaman olması gerekir bir protein konumunu belirleme bu çift veya birden çok hedefleme proteinlerin hatırladı hücrelerinde oluşur. 100’den fazla çift hedeflenmiş proteinler kloroplast/plastitler ve mitokondri4ve çok sayıda mitokondri için hedeflenmiş proteinler için açıklanan ve tanımladıkları da5bilinir. Ayrıca, yeniden yer altında belirli uyaranlara, örneğin oksidatif stres, proteinlerin hücre biyolojisi6‘ gelişmekte olan bir temadır. Böylece, proteinler konumunun biyoloji eğitimi bağlamında dikkate alınması gerekir ve yaklaşımlar çeşitli belirlemek ve konumu2doğrulamak için kullanılır.

Mitokondri homojenizasyon tarafından bitki dokulardan genellikle izole, mitokondri serbest bırakmak için hücre duvarı açık kırma ve mitokondri zarar değil arasında bir denge gereklidir. Geleneksel olarak, patates ve karnabahar, etkinliğini korumak için çeşitli bileşenleri ile bir arabellekte bir sıvı özü yapmak ev blender/meyve sıkacağı cihazları kullanarak homojenizasyon içerir. Mitokondri bezelye yaprakları, düşük yalıtım (genç fidan (~ 10 gün eski), kullanarak mitokondrial yalıtım için popüler bir malzeme yaprak malzeme yumuşak olduğu gibi hücreleri parçalayıcı bir blender kullanır. Arabidopsis thaliana T-DNA insertional knock-out satırları durumu ile fonksiyonel çalışmalar yürütmek için mitokondri arındırmak için ihtiyaç mitokondri yaprak, kök veya çiçek yalıtmak için yöntem geliştirme gerektirdiği doku. Genel olarak diğer bitkiler için geliştirilen yöntemler iyi7, optimize için gerekli olan malzeme taşlama ikramiye ile çalıştı. Arabidopsis için bu çeşitli şekillerde (aşağıya bakınız) elde edilebilir ve doku türleri (kök sürgün karşı) arasında farklılık gösterir. Sürekli degrade kullanımı da farklı organları üzerinden mitokondri yoğunluğu olarak optimize edilebilir ya da gelişim aşamalarında anlamına gelir onlar farklı geçirebilirsiniz. Böylece, en fazla ayrılması için degradenin yoğunluğu en iyi ayrılık ulaşmak için emin olmak için rafine olabilir.

Bir zamanlar saf mitokondri-ebilmek var olmak kullanılmış çalışmalar, protein, tRNA alımını deneyleri, enzim aktivitesi deneyleri, solunum zinciri ölçümleri ve Batı Leke analizleri de dahil olmak üzere çeşitli için. İzole mitokondri de protein bereket kütle spektrometresi analizleri için kullanılabilir. Hedeflenen birden çok tepki (MRM) analizleri izleme sağlayan miktar için proteinler tanımlanmış, ancak önemli tahlil geliştirme gerektirir. Buna ek olarak, miktar Dimetil veya diğer izotop etiketleri8, roman biyolojik anlayışlar ortaya çıkarmak için kullanılan tüm Proteom arasında farklılıklar belirlenmesinde bir keşif yaklaşım sağlar.

Protocol

Bu iletişim kuralı üzerinden sürekli kolloidal yoğunluk gradyanlar kullanarak topraklarında yetişen Arabidopsis thaliana organları bozulmamış mitokondri yalıtım için kullanılır. Tüm yordamları malzeme topluluğu takip 4 ° C’de gerçekleştirilir 1. hazırlık orta, yıkama tamponu ve degrade çözümleri öğütme Orta (eksi askorbat ve sistein) ve Tablo 1 başına 2 x yıkama arabellek 200 mL bir gün önce yalıtım öğütme 300 mL hazı…

Representative Results

Bu iletişim kuralını kullanan, biz farklı mitokondrial proteinler SDS-sayfa ve immunoblotting tarafından tespit edebildik. Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi su kültürü dokusundan izole protein zayıf bant (2 µg) tespit etmek yeterli olur. Sinyal şiddeti orantılı olarak yüklü miktarda artırır. Mitokondri plakaları (şekil 3B), yüksek ışık stres yanıt büyümüş dokulara gelen izole için farklı genotip t…

Discussion

5 mg dan büyük verim kez ayrıntılı zımpara ile elde edilebilir genellikle, mitokondri Arabidopsis üzerinden işlemleri olan mitokondri 3 mg kadar verimleri yaklaşık 80-100 3 – 4 – hafta eski bitkiler, bırakır ancak. Verim büyüme koşullarına ile değişiklik gösterebilir ve mitokondri yapısı yaşlanma9sırasında bakımlı görünüyor olsa da senesce, gider önemli ölçüde azalır. İyi bir verim elde etmek için en önemli özelliklerine mitokondri serbest bırakmak hücrelere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmada bir Avustralya Araştırma Konseyi mükemmellik merkezi olarak bitki enerji Biyoloji CE140100008, bir Avustralya Araştırma Konseyi gelecek Bursu (FT130100112) MWM ve Feodor Lynen araştırma bursu (Alexander von Humboldt tarafından desteklenmiştir Vakfı, Almanya) JS için.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A2754 Chemical
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Chemical, dissolve in ethanol
AOX antibody from Tom Elthon Elthon et al., 1989
Ascorbate Sigma-Aldrich A0157 Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.
ATP Sigma-Aldrich A26209 Chemical
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSAS 1.0 Chemical
Clarity western ECL substrate Bio-Rad Laboratories 1705061 Chemical
Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells Bio-Rad Laboratories 5678104 Chemical
Cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Cytochrome c Sigma-Aldrich C3131 Chemical
Difco Agar, granulated BD Biosciences 214530 Chemical
Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632 Chemical
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich E5134 Chemical
Gamborg B-5 Basal Medium Austratec G398-100L Chemical
Gamborg Vitamin Solution (1000x) Austratec G219-100ML Chemical
Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706516-2ml Chemical
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706515-2ml Chemical
L-Cysteine Sigma C7352-100G Chemical
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 230391 Chemical
Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) Austratec M524-100L Chemical
Myxothiazol Sigma-Aldrich T5580 Chemical, dissolve in ethanol
NADH Sigma-Aldrich N8129 Chemical
Ndufs4 antibody from Etienne Meyer Meyer et al., 2009
n-Propyl gallate Sigma-Aldrich P3130 Chemical, dissolve in ethanol
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Chemical, colloidal density gradient
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Sigma-Aldrich PVP40 Chemical
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 Chemical
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Chemical
Sodium chloride Chem-Supply SA046 Chemical
Sodium dithionite Sigma-Aldrich 157953 Chemical
Sodium L-ascorbate Sigma A4034-100G Chemical
Succinate Sigma-Aldrich S2378 Chemical
Sucrose Chem-Supply SA030 Chemical
TES Sigma-Aldrich T1375 Chemical
Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) Sigma-Aldrich 221368 Chemical
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100 Chemical, detergent
Western Blocking Reagent Sigma 11921681001 Chemical
Balance Mettler Toledo XS204 Equipment
Beakers Isolab 50 mL
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-26XP Equipment
Centrifuge tubes Nalgene 3117-9500 Equipment
Circulator Julabo 1124971 Attached to oxygen electrode chamber
Conical flask Isolab 500 mL
Dropper 3 mL
Fixed angle rotor Beckman Coulter JA25.5 Equipment
Funnel Per Alimenti 14 cm For filtering
Gradient pourer Bio-Rad 165-4120 For preparation of gradients
Magnetic Stirrer ATE VELP Scientifica F20300165 Equipment
Miracloth VWR EM475855-1R Filtration material
Mortar and pestle Jamie Oliver Granite, 6 Inch Equipment
O2view Hansatech Instruments Oxygen monitoring software
Oxygraph Plus System Hansatech Instruments 1187253 Clark-type oxygen electrode
Paintbrush Artist first choice 1008R-12
Parafilm Bemis PM-996 plastic paraffin film
Peristaltic pump Gilson F155001 For preparation of gradients
PVC peristaltic tubing Gilson F117930 For preparation of gradients
Water bath VELP Scientifica OCB Equipment

References

  1. Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
  2. Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
  3. Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
  4. Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
  5. Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
  6. Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code – Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
  7. Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
  8. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
  9. Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
  10. Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
  11. Lee, C. P., Eubel, H., O’Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
  12. Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
  13. Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
  14. Peters, K., et al. Complex I – complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
  15. Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
  16. Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).

Play Video

Cite This Article
Lyu, W., Selinski, J., Li, L., Day, D. A., Murcha, M. W., Whelan, J., Wang, Y. Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (131), e56627, doi:10.3791/56627 (2018).

View Video