Summary

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Published: January 05, 2018
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Summary

Como las mitocondrias son sólo un pequeño porcentaje de la célula de la planta, tienen que ser purificado para una gama de estudios. Las mitocondrias pueden ser aisladas de una variedad de órganos de la planta de homogeneización, seguido de centrifugación gradiente diferencial y densidad para obtener una fracción altamente purificada mitocondrial.

Abstract

Las mitocondrias son organelos esenciales involucrados en numerosas vías metabólicas en las plantas, en particular la producción de trifosfato de adenosina (ATP) de la oxidación de compuestos reducidos como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavina adenina dinucleótido (FADH2). La anotación completa del genoma de Arabidopsis thaliana ha establecido como el más ampliamente utilizado sistema de modelo de planta, y así la necesidad de purificar las mitocondrias de una variedad de órganos (hojas, raíz o flor) es necesaria aprovechar las herramientas que ya están disponibles para Arabidopsis estudiar biología mitocondrial. Las mitocondrias están aisladas por la homogeneización del tejido usando una variedad de enfoques, seguido por una serie de pasos de centrifugación diferencial produce un pellet mitocondrial cruda que más se purifica mediante gradiente de densidad coloidal continua centrifugación. Posteriormente se retira el material coloidal densidad por múltiples pasos de centrifugación. A partir de 100 g de tejido foliar fresco, 2-3 mg de mitocondrias puede rutinariamente obtener. Experimentos respiratorios en las mitocondrias Mostrar tasas típicas de 100-250 nmol O2 min-1 mg proteína mitocondrial total-1 (tasa de NADH-dependiente) con la capacidad de utilizar diferentes sustratos e inhibidores para determinar que sustratos son ser oxidados y la capacidad de las alternativa y citocromo oxidasas terminales. Este protocolo describe un método de aislamiento de las mitocondrias de las hojas de Arabidopsis thaliana mediante gradientes de densidad coloidal continua y un eficiente mediciones respiratoria de las mitocondrias planta purificada.

Introduction

La historia de la investigación mitocondrial planta va detrás más de 100 años1. Las mitocondrias intactas se aisló por primera vez en la temprana década de 1950 utilizando centrifugación diferencial. La aparición de un gradiente de densidad coloidal en la década de 1980 permitió que las mitocondrias ser purificada sin sufrir ajuste osmótico. Mientras que las mitocondrias purificadas gradiente son convenientes para la mayoría de los casos, debido a la sensibilidad de la espectrometría de masas, contaminantes aún relativamente de menor importancia pueden ser detectados y pueden ser asignados inadecuadamente una localización mitocondrial2. El uso de electroforesis de flujo libre puede quitar ambos plastidic y peroxisoma contaminación3, pero sin flujo de electroforesis es una técnica altamente especializada y no es necesaria para la gran mayoría de los estudios. Además, cuando determinar la ubicación de una proteína debe ser recordado doble o múltiples objetivos de proteínas ocurre en las células. Más de 100 proteínas específicas duales se describen para cloroplastos/plástidos y mitocondrias4y un número de proteínas dirigida a las mitocondrias y los peroxisomas también se conocen5. Además, la reubicación de proteínas bajo estímulos específicos, por ejemplo, el estrés oxidativo, es un tema emergente en la biología de la célula6. Por lo tanto, debe ser considerado en el contexto de la biología que estudia la localización de las proteínas, y una variedad de métodos se utilizan para determinar y verificar la ubicación2.

Las mitocondrias son generalmente aisladas de los tejidos vegetales por homogeneización, un equilibrio es necesario entre rompiendo la pared celular para liberar las mitocondrias y no dañar las mitocondrias. Tradicionalmente con patata y coliflor, homogeneización implica el uso de aparatos domésticos licuadora/exprimidor para hacer un extracto líquido en un tampón con varios componentes para mantener la actividad. Aislamiento de mitocondrias de hojas de guisante, (un material popular para aislamiento mitocondrial utilizando plantas de semillero jóvenes (~ 10 días), utiliza una batidora para lyse las células como el material de la hoja es suave. Con la disponibilidad de líneas de knock-out insertional T-DNA de Arabidopsis thaliana , la necesidad de ser capaz de purificar las mitocondrias para llevar a cabo estudios funcionales ha requerido el desarrollo de métodos para aislar mitocondrias de hoja, raíz o flor tejido. En general los métodos desarrollados para otras plantas trabajaban bien7, con la gratificación que moler del material necesario para ser optimizado. Para Arabidopsis esto puede lograrse en una variedad de maneras (véase abajo) y difiere entre tipos de tejidos (raíz versus shoot). El uso de la gradiente continuo también puede ser optimizado como la densidad de las mitocondrias de distintos órganos o etapas de desarrollo medio pueden migran diferentemente. Así, para la separación máxima la densidad del gradiente puede ser refinada para lograr la mejor separación.

Una vez purificada la mitocondria puede utilizarse para una variedad de estudios, incluyendo los experimentos de absorción de proteína y tRNA, ensayos de actividad enzimática, las medidas de la cadena respiratoria y mancha blanca /negra occidental análisis. Las mitocondrias aisladas pueden utilizarse también para los análisis de espectrometría de masas de la abundancia de la proteína. Objetivo reacción múltiple monitoreo análisis (MRM) permite la cuantificación de definido de las proteínas, pero requieren el desarrollo de los ensayos significativos. En cambio, cuantificación por dimetil u otro isótopo etiquetas8, proporciona un enfoque de descubrimiento en la identificación de las diferencias en el proteoma completo que puede utilizarse para descubrir nuevos conocimientos biológicos.

Protocol

Este protocolo se utiliza para el aislamiento de las mitocondrias intactas de Arabidopsis thaliana órganos cultivados en suelo mediante gradientes de densidad coloidal continua. Después de la recolección de material todos los procedimientos se llevan a cabo a 4 ° C. 1. preparación del tampón de lavado, medio y soluciones de gradiente Preparar 300 mL de pulido medio (menos ascorbato y cisteína) y 200 mL de tampón de lavado x 2 según la tabla 1 un dí…

Representative Results

Mediante este protocolo, hemos podido detectar diferentes proteínas mitocondriales por SDS-PAGE e immunoblotting. Como se muestra en la Figura 3A, la proteína aislada de tejido de la cultura del agua es suficiente para detectar una banda débil (2 μg). Intensidad de la señal aumenta proporcionalmente a las cantidades cargadas. De las mitocondrias aisladas de tejidos cultivados en placas (figura 3B), la respuesta al estrés de…

Discussion

Por lo general, aislamiento de mitocondrias de Arabidopsis deja rendimientos encima de 3 mg de mitocondrias de aproximadamente 80-100 3 – 4 semana – viejas plantas, aunque a menudo se logra rendimientos de más de 5 mg con fondo pulido. El rendimiento varía con condiciones de crecimiento y disminuye dramáticamente como hojas marchitaron, aunque las mitocondrias estructura parece mantenerse bien durante la senescencia9. Una de las características más importantes para obtener un buen rendimiento…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por un australiano Consejo centro de excelencia en la investigación en planta de energía CE140100008 de biología, un australiano Consejo futuro beca de investigación (FT130100112) y MWM, una beca de investigación de Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fundación, Alemania) a JS.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A2754 Chemical
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Chemical, dissolve in ethanol
AOX antibody from Tom Elthon Elthon et al., 1989
Ascorbate Sigma-Aldrich A0157 Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.
ATP Sigma-Aldrich A26209 Chemical
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSAS 1.0 Chemical
Clarity western ECL substrate Bio-Rad Laboratories 1705061 Chemical
Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells Bio-Rad Laboratories 5678104 Chemical
Cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Cytochrome c Sigma-Aldrich C3131 Chemical
Difco Agar, granulated BD Biosciences 214530 Chemical
Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632 Chemical
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich E5134 Chemical
Gamborg B-5 Basal Medium Austratec G398-100L Chemical
Gamborg Vitamin Solution (1000x) Austratec G219-100ML Chemical
Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706516-2ml Chemical
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706515-2ml Chemical
L-Cysteine Sigma C7352-100G Chemical
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 230391 Chemical
Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) Austratec M524-100L Chemical
Myxothiazol Sigma-Aldrich T5580 Chemical, dissolve in ethanol
NADH Sigma-Aldrich N8129 Chemical
Ndufs4 antibody from Etienne Meyer Meyer et al., 2009
n-Propyl gallate Sigma-Aldrich P3130 Chemical, dissolve in ethanol
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Chemical, colloidal density gradient
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Sigma-Aldrich PVP40 Chemical
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 Chemical
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Chemical
Sodium chloride Chem-Supply SA046 Chemical
Sodium dithionite Sigma-Aldrich 157953 Chemical
Sodium L-ascorbate Sigma A4034-100G Chemical
Succinate Sigma-Aldrich S2378 Chemical
Sucrose Chem-Supply SA030 Chemical
TES Sigma-Aldrich T1375 Chemical
Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) Sigma-Aldrich 221368 Chemical
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100 Chemical, detergent
Western Blocking Reagent Sigma 11921681001 Chemical
Balance Mettler Toledo XS204 Equipment
Beakers Isolab 50 mL
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-26XP Equipment
Centrifuge tubes Nalgene 3117-9500 Equipment
Circulator Julabo 1124971 Attached to oxygen electrode chamber
Conical flask Isolab 500 mL
Dropper 3 mL
Fixed angle rotor Beckman Coulter JA25.5 Equipment
Funnel Per Alimenti 14 cm For filtering
Gradient pourer Bio-Rad 165-4120 For preparation of gradients
Magnetic Stirrer ATE VELP Scientifica F20300165 Equipment
Miracloth VWR EM475855-1R Filtration material
Mortar and pestle Jamie Oliver Granite, 6 Inch Equipment
O2view Hansatech Instruments Oxygen monitoring software
Oxygraph Plus System Hansatech Instruments 1187253 Clark-type oxygen electrode
Paintbrush Artist first choice 1008R-12
Parafilm Bemis PM-996 plastic paraffin film
Peristaltic pump Gilson F155001 For preparation of gradients
PVC peristaltic tubing Gilson F117930 For preparation of gradients
Water bath VELP Scientifica OCB Equipment

References

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Cite This Article
Lyu, W., Selinski, J., Li, L., Day, D. A., Murcha, M. W., Whelan, J., Wang, Y. Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (131), e56627, doi:10.3791/56627 (2018).

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