Summary

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Published: January 05, 2018
doi:

Summary

Da Mitochondrien nur ein kleiner Prozentsatz der Pflanzenzelle sind, benötigen sie für eine Reihe von Studien gereinigt werden. Mitochondrien können aus einer Vielzahl von Pflanzenorganen durch Homogenisierung, gefolgt von Differential und Dichte Gradienten Zentrifugation zu einem hochgereinigten mitochondriale Bruchteil isoliert werden.

Abstract

Mitochondrien sind wesentliche Organellen beteiligt zahlreiche Stoffwechselwege in Pflanzen, vor allem die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) aus der Oxidation von reduzierten Verbindungen wie Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide (NADH) und Flavin Adenin Dinucleotide (FADH2). Die vollständige Kommentierung der Arabidopsis Thaliana Genom wurde es festgestellt, als die am weitesten Modell der Anlage verbreitete, und somit die Notwendigkeit, Mitochondrien aus einer Vielzahl von Organen (Blatt, Wurzel oder Blüte) zu reinigen notwendig ist, die Werkzeuge in vollem Umfang nutzen, sind jetzt verfügbar für Arabidopsis, mitochondriale Biologie zu studieren. Mitochondrien sind durch Homogenisierung des Gewebes mit einer Vielzahl von Ansätzen, gefolgt von einer Reihe differentielle Zentrifugation Schritte produzieren einen groben mitochondriale Pellet, der weiter gereinigt wird mit kontinuierlicher kolloidales Dichtegradienten isoliert Zentrifugation. Das kolloidale Dichte Material wird anschließend durch mehrere Zentrifugation Schritte entfernt. Ausgehend von 100 g frisches Blattgewebe, 2-3 mg der Mitochondrien routinemäßig erhalten. Atemwege Experimente auf diese Mitochondrien zeigen typische Preise von 100-250 Nmol O2 min-1 mg Gesamtprotein mitochondriale-1 (NADH-abhängige Rate) mit der Fähigkeit, verschiedene Substrate und Inhibitoren zu verwenden, um festzustellen, welche Substrate werden oxidiert wird und die Kapazität der Alternative und Cytochrom terminal Oxidasen. Dieses Protokoll beschreibt eine Isolierung der Mitochondrien von Arabidopsis Thaliana Blätter mit kontinuierlichen kolloidales Dichtegradienten und eine effiziente Atemwege Messungen der gereinigten Anlage Mitochondrien.

Introduction

Die Geschichte der mitochondrialen Pflanzenforschung reicht über 100 Jahre1. Intakte Mitochondrien wurden zuerst in den frühen 1950er Jahren isoliert mit differentielle Zentrifugation. Das Aufkommen der kolloidalen Dichtegradient in den 1980er Jahren erlaubt Mitochondrien gereinigt werden, ohne Leiden osmotische Anpassung. Während gradient gereinigte Mitochondrien geeignet für die meisten Zwecke wegen der Empfindlichkeit der Massenspektrometrie sind, auch relativ geringfügige Verunreinigungen können erkannt werden und eine mitochondriale Lage2unangemessen zugewiesen werden können. Die Verwendung von der free Flow-Elektrophorese kann beide plastidic entfernen und Peroxisom Kontamination3, aber frei fließen Elektrophorese ist eine hochspezialisierte Technik und ist für die überwiegende Mehrheit der Studien nicht erforderlich. Darüber hinaus tritt bei Bestimmung der Lage eines Proteins muss es sein, dass zwei oder mehrere targeting von Proteinen erinnert in Zellen. Über 100 dual gezielte Proteine sind beschrieben für Chloroplasten/Plastiden und Mitochondrien4und eine Reihe Proteine gezielt an Mitochondrien und Peroxisomen sind auch5bekannt. Darüber hinaus befindet sich re Proteine unter spezifischen Reize, z. B. oxidativen Stress, eine aufkommende Thema in Zelle Biologie6. So die Position der Proteine im Kontext der studierte Biologie betrachtet werden muss, und eine Vielzahl von Ansätzen dienen zu ermitteln und überprüfen der Position2.

Mitochondrien sind in der Regel von Pflanzengewebe durch Homogenisierung isoliert, ein Gleichgewicht zwischen Aufbrechen der Zellwand um Mitochondrien zu lösen, und nicht zu schädigen die Mitochondrien erforderlich ist. Traditionell werden mit Kartoffeln und Blumenkohl, Homogenisierung Haushalt Mixer/Entsafter Apparat zu einem Flüssigextrakt in einem Puffer mit verschiedenen Komponenten zu erhalten. Isolation von Mitochondrien aus Erbse Blätter (ein beliebtes Material für mitochondriale Isolierung mit Jungpflanzen (~ 10 Tage alt), nutzt ein Blender, um Zellen zu lösen, da das Blattmaterial weich ist. Mit der Verfügbarkeit von Arabidopsis Thaliana T-DNA insertional Knock-out-Linien erforderte die Notwendigkeit, Mitochondrien, funktionelle Untersuchungen durchzuführen zu reinigen können die Entwicklung von Methoden zur Mitochondrien aus Blatt, Wurzel oder Blüte isolieren Gewebe. Insgesamt arbeitete für andere Pflanzen entwickelten Methoden gut7mit Perquisite, die Schleifen des Materials musste optimiert werden. Für Arabidopsis dies in eine Vielzahl von Möglichkeiten (siehe unten) erreicht werden kann, und unterscheidet sich zwischen Gewebetypen (Wurzel im Vergleich zu schießen). Die Verwendung des kontinuierlichen Verlaufs auch optimiert werden als die Dichte von Mitochondrien aus verschiedenen Organen oder Entwicklungsstufen bedeutet, dass sie anders migrieren können. Für maximale Trennung kann so die Dichte des Gradienten verfeinert, um sicherzustellen, um beste Trennung zu erreichen.

Einmal gereinigt, die Mitochondrien können für eine Vielzahl von Studien, einschließlich Protein und tRNA-Aufnahme-Experimente, Enzym-Aktivität-Assays, Atmungskette Messungen und western-Blot Analysen verwendet werden. Isolierte Mitochondrien können auch für Massenspektrometrie Analysen der Protein Fülle verwendet werden. Gezielte mehrere Reaktion monitoring (MRM) Analysen ermöglicht die Quantifizierung der Proteine definiert, aber erfordern erhebliche Assay-Entwicklung. Im Gegensatz dazu bietet Quantifizierung von Dimethyl oder anderen Isotop Etiketten8, einen Entdeckung Ansatz bei der Identifizierung von Differenzen über das ganze Proteom, das verwendet werden kann, um neue biologische Einblicke aufzudecken.

Protocol

Dieses Protokoll dient zur Isolierung von intakte Mitochondrien von Arabidopsis Thaliana Organe auf Boden mit kontinuierlichen kolloidales Dichtegradienten angebaut. Alle Verfahren, die nach der Sammlung des Materials erfolgt bei 4 ° C. 1. Vorbereitung des Schleifens Medium, Waschpuffer und Gradient Lösungen Bereiten Sie 300 mL des Schleifens Medium (minus Ascorbat und Cystein) und 200 mL 2 X Waschpuffer pro Tabelle 1 einen Tag vor der Isolation, bei 4 ° …

Representative Results

Dieses Protokoll konnten wir verschiedene mitochondriale Proteine durch SDS-PAGE und Immunoblotting erkennen. Wie in Abbildung 3Adargestellt, ist das Protein isoliert vom Wasser Kultur Gewebe ausreichen, um ein schwaches Band (2 µg) zu erkennen. Signalintensität steigt proportional zu den Beträgen geladen. Für Mitochondrien isoliert von Gewebe gewachsen auf Tellern (Abb. 3 b), die Reaktion auf hohe Lichtstress kann Behandlung…

Discussion

In der Regel verlässt Isolation von Mitochondrien aus Arabidopsis Renditen bis 3 mg der Mitochondrien von ca. 80-100 3 – 4 – Wochen alten Pflanzen, obwohl Renditen von mehr als 5 mg oft mit gründlichen Schleifen erreicht werden können. Der Ertrag variiert je nach Wachstumsbedingungen und sinkt dramatisch, als Senesce, verlässt obwohl Mitochondrien Struktur scheint während der Seneszenz9gut gepflegt werden. Eines der wichtigsten Features, einen guten Ertrag zu erhalten ist die Methode des Schl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch eine australische Forschung Rat Centre of Excellence in Anlage Energie Biologie CE140100008, eine australische Rat Zukunft Forschungsstipendium (FT130100112), MWM und ein Feodor-Lynen-Forschungsstipendium (Alexander von Humboldt Stiftung, Deutschland), JS.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A2754 Chemical
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Chemical, dissolve in ethanol
AOX antibody from Tom Elthon Elthon et al., 1989
Ascorbate Sigma-Aldrich A0157 Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.
ATP Sigma-Aldrich A26209 Chemical
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSAS 1.0 Chemical
Clarity western ECL substrate Bio-Rad Laboratories 1705061 Chemical
Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells Bio-Rad Laboratories 5678104 Chemical
Cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Cytochrome c Sigma-Aldrich C3131 Chemical
Difco Agar, granulated BD Biosciences 214530 Chemical
Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632 Chemical
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich E5134 Chemical
Gamborg B-5 Basal Medium Austratec G398-100L Chemical
Gamborg Vitamin Solution (1000x) Austratec G219-100ML Chemical
Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706516-2ml Chemical
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706515-2ml Chemical
L-Cysteine Sigma C7352-100G Chemical
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 230391 Chemical
Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) Austratec M524-100L Chemical
Myxothiazol Sigma-Aldrich T5580 Chemical, dissolve in ethanol
NADH Sigma-Aldrich N8129 Chemical
Ndufs4 antibody from Etienne Meyer Meyer et al., 2009
n-Propyl gallate Sigma-Aldrich P3130 Chemical, dissolve in ethanol
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Chemical, colloidal density gradient
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Sigma-Aldrich PVP40 Chemical
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 Chemical
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Chemical
Sodium chloride Chem-Supply SA046 Chemical
Sodium dithionite Sigma-Aldrich 157953 Chemical
Sodium L-ascorbate Sigma A4034-100G Chemical
Succinate Sigma-Aldrich S2378 Chemical
Sucrose Chem-Supply SA030 Chemical
TES Sigma-Aldrich T1375 Chemical
Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) Sigma-Aldrich 221368 Chemical
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100 Chemical, detergent
Western Blocking Reagent Sigma 11921681001 Chemical
Balance Mettler Toledo XS204 Equipment
Beakers Isolab 50 mL
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-26XP Equipment
Centrifuge tubes Nalgene 3117-9500 Equipment
Circulator Julabo 1124971 Attached to oxygen electrode chamber
Conical flask Isolab 500 mL
Dropper 3 mL
Fixed angle rotor Beckman Coulter JA25.5 Equipment
Funnel Per Alimenti 14 cm For filtering
Gradient pourer Bio-Rad 165-4120 For preparation of gradients
Magnetic Stirrer ATE VELP Scientifica F20300165 Equipment
Miracloth VWR EM475855-1R Filtration material
Mortar and pestle Jamie Oliver Granite, 6 Inch Equipment
O2view Hansatech Instruments Oxygen monitoring software
Oxygraph Plus System Hansatech Instruments 1187253 Clark-type oxygen electrode
Paintbrush Artist first choice 1008R-12
Parafilm Bemis PM-996 plastic paraffin film
Peristaltic pump Gilson F155001 For preparation of gradients
PVC peristaltic tubing Gilson F117930 For preparation of gradients
Water bath VELP Scientifica OCB Equipment

References

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Cite This Article
Lyu, W., Selinski, J., Li, L., Day, D. A., Murcha, M. W., Whelan, J., Wang, Y. Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (131), e56627, doi:10.3791/56627 (2018).

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