Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana
Summary
Mitochondriën zijn slechts een klein percentage van de plant cel, moeten ze voor een aantal studies worden gezuiverd. Mitochondriën kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid van organen van de plant door homogenisering, gevolgd door de differentiaal- en dichtheid kleurovergang centrifugeren te verkrijgen van een hoogst gezuiverde mitochondriale fractie.
Abstract
Mitochondriën zijn essentiële organellen die betrokken zijn bij talrijke stofwisselingsroutes in planten, met name de productie van adenosine trifosfaat (ATP) van de oxidatie van verminderde verbindingen zoals nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) en flavine adenine dinucleotide (FADH2). De volledige annotatie van het genoom van Arabidopsis thaliana heeft opgericht als de meest plant modelsysteem gebruikte, en de noodzaak om te zuiveren van mitochondriën uit allerlei organen (blad, wortel of bloem) dus nodig is om volledig gebruik maken van de instrumenten die zijn nu beschikbaar voor Arabidopsis mitochondriale biologie studeren. Mitochondriën zijn geïsoleerd door de homogenisering van de weefsel met behulp van een verscheidenheid van benaderingen, gevolgd door een reeks stappen van de differentiële centrifugeren produceren een ruwe mitochondriale pellet dat is verder gezuiverd met behulp van continue colloïdale dichtheid verloop centrifugeren. De colloïdale dichtheid materiaal wordt daarna verwijderd door meerdere centrifugeren stappen. Vanaf 100 g verse blad weefsel, kan 2-3 mg van de mitochondriën worden routinematig verkregen. Respiratoire experimenten op deze mitochondriën weer typische tarieven van 100-250 nmol O2 min-1 mg totale mitochondriale eiwit-1 (NADH-afhankelijke tarief) met de mogelijkheid om diverse substraten en inhibitors gebruiken om te bepalen welke substraten zijn wordt geoxideerd en de capaciteit van de alternatieve en cytochroom terminal oxidasen. Dit protocol beschrijft een methode van de isolatie van de mitochondriën van Arabidopsis thaliana bladeren met behulp van continue colloïdale dichtheid verlopen en een efficiënte respiratoire metingen van gezuiverde plant mitochondriën.
Introduction
De geschiedenis van mitochondriale plantenonderzoek gaat terug over 100 jaar1. Intacte mitochondria werden voor het eerst geïsoleerd in de vroege jaren 1950 met behulp van differentiële centrifugeren. De komst van een colloïdale dichtheid verloop in de jaren 1980 toegestaan mitochondriën zonder lijden osmotische aanpassing worden gezuiverd. Terwijl kleurovergang gezuiverde mitochondriën geschikt voor de meeste doeleinden, vanwege de gevoeligheid van de Spectrometrie van de massa zijn, kunnen zelfs relatief geringe verontreinigingen worden gedetecteerd en mogelijk een mitochondriale locatie2ten onrechte is toegewezen. Het gebruik van gratis stroom elektroforese kan verwijderen van beide plastidic en peroxisoom besmetting3, maar vrij stromen elektroforese is een gespecialiseerde techniek en is niet vereist voor de overgrote meerderheid van de studies. Bovendien komt voor wanneer bepalen de locatie van een eiwit dient te worden herinnerd dat dubbele of meerdere targeting van eiwitten in cellen. Meer dan 100 dual gerichte eiwitten worden beschreven voor een aantal eiwitten gericht op mitochondriën, chloroplasten/plastiden en mitochondriën4en peroxisomen zijn ook bekend van5. Bovendien is de nieuwe locatie van eiwitten onder specifieke stimuli, zoals oxidatieve stress, een opkomende thema in cel biologie6. Dus, de locatie van eiwitten moet worden beschouwd in het kader van de biologie studeerde en een aantal verschillende benaderingen worden gebruikt om te bepalen en controleren of de locatie2.
Mitochondriën zijn meestal geïsoleerd van plantaardige weefsels door homogenisering, een evenwicht nodig tussen de celwand mitochondriën vrij te open te breken, en niet schadelijk de mitochondriën. Traditioneel, met aardappel en bloemkool omvat homogenisering het gebruik van huishoudelijke blender/juicer toestellen te maken van een vloeibaar extract in een buffer met diverse componenten te houden activiteit. Isolatie van de mitochondriën van pea bladeren, (een populair materiaal voor mitochondriale isolatie met behulp van jonge zaailingen (~ 10 dagen oud), maakt gebruik van een blender lyse cellen zoals het blad materiaal zacht is. Met de beschikbaarheid van Arabidopsis thaliana T-DNA dat knock-out lijnen, is de noodzaak om het zuiveren van de mitochondriën van functionele studies te kunnen de ontwikkeling van methoden om te isoleren van de mitochondriën van de blad-, wortel- of bloem noodzakelijk weefsel. Over het geheel genomen werkte de methoden ontwikkeld voor andere planten goed7, met de perquisite die slijpen van het materiaal nodig om te worden geoptimaliseerd. Voor Arabidopsis dit kan worden bereikt in een verscheidenheid van manieren (zie hieronder), en verschilt tussen weefseltypes (HLA) (wortel versus schieten). Het gebruik van het continu verloop kan ook worden geoptimaliseerd als de dichtheid van mitochondriën van verschillende organen of ontwikkelingsstadia betekent ze anders kunnen migreren. Dus, voor maximale scheiding de dichtheid van het verloop kan worden verfijnd om ervoor te zorgen om de beste scheiding.
Eenmaal gezuiverde de mitochondriën kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van studies, met inbegrip van eiwit en tRNA opname experimenten, enzym activiteit testen, respiratoire keten metingen en analyses van de westelijke vlek. Geïsoleerde mitochondriën kunnen ook worden gebruikt voor spectrometrische analyse van eiwit overvloed. Gerichte meerdere reactie (MRM) analyses controle zorgt voor de kwantificering van eiwitten gedefinieerd, maar vereisen aanzienlijke assay ontwikkeling. In tegenstelling, biedt kwantificering dimethyl of andere isotoop etiketten8, een aanpak van de ontdekking in het identificeren van verschillen over de hele Proteoom die kan worden gebruikt om te ontdekken van nieuwe biologische inzichten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolatie van de mitochondriën van Arabidopsis laat meestal opbrengsten van 3 mg mitochondria van ongeveer 80-100 3 – 4 – weken oude planten, hoewel rendementen van meer dan 5 mg kunnen vaak worden bereikt met grondige slijpen. Het rendement varieert met de voorwaarden van groei en vermindert dramatisch als verlaat senesce, hoewel mitochondriën structuur lijkt te worden goed onderhouden tijdens senescentie9. Een van de meest kritieke functies tot het verkrijgen van een goede opbrengst is de metho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door een Australische onderzoek Raad Centre of Excellence in de Plant energie biologie CE140100008, een Australisch onderzoek Raad toekomst Fellowship (FT130100112) te MWM, een Feodor Lynen Research Fellowship (Alexander von Humboldt Stichting, Duitsland) naar JS.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code – Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O’Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I – complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
