Summary

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Published: January 05, 2018
doi:

Summary

Как Митохондрии являются лишь небольшой процент растительной клетки, они должны быть очищены для целого ряда исследований. Митохондрии могут быть изолированы от различных органов растений, гомогенизации, следуют дифференциальных и плотность градиентного центрифугирования для получения высокоочищенных митохондриальной дроби.

Abstract

Митохондрии являются основные органеллы, участвует в многочисленных метаболических путей в растениях, прежде всего производства аденозинтрифосфата (АТФ) от окисления снижение соединений, таких как никотинамид аденин динуклеотид (NADH) и флавин аденин динуклеотид (2ГВС). Полная Аннотация Arabidopsis thaliana генома установил его как наиболее широко используемых растений модель системы, и таким образом необходимость очистить митохондрий от различных органов (лист, корень или цветок) необходимо в полной мере использовать инструменты, Теперь доступны для Arabidopsis для изучения митохондриальной биологии. Митохондрии, изолируются гомогенизацией тканей, с использованием различных подходов, последовал ряд шагов дифференциального центрифугирования, производству сырой митохондриальной Пелле, который далее очищается с помощью непрерывной коллоидных плотность градиент Центрифугирование. Коллоидный плотность материала впоследствии удаляется несколько шагов центрифугирования. Начиная с 100 г свежих листьев ткани, обычно получается 2-3 мг митохондрий. Респираторные эксперименты на этих митохондрий отображения типичный ставки 100-250 нмоль O2 мин-1 мг всего митохондриальных белок-1 (NADH-зависимая скорость) с возможностью использования различных субстратов и ингибиторов для определения субстраты окисляются и возможностей альтернативных и цитохром терминала оксидазы. Этот протокол описывает метод изоляции митохондрий от Arabidopsis thaliana листья с помощью непрерывной коллоидных плотности градиенты и эффективного дыхания измерения очищенный завод митохондрий.

Introduction

История исследования растений митохондриальной восходит более чем 100 лет1. Нетронутыми митохондрии были впервые выделен в начале 1950-х годов с помощью дифференциального центрифугирования. Появление коллоидных плотность градиента в 1980-х допускается митохондрий очищаться без страданий осмотического перестройки. В то время как градиент очищенный митохондрии подходят для большинства целей, из-за чувствительности масс-спектрометрии, даже сравнительно незначительных загрязнений могут быть обнаружены и может быть ненадлежащим образом назначен митохондриальной расположение2. Использование свободного потока электрофореза могут удалить оба plastidic и Пероксисома загрязнение3, но свободный поток электрофорез узкоспециализированные техника и не требуется для подавляющего большинства исследований. Кроме того, когда определение расположения белка, который она должна быть вспомнил, что двойное или несколько ориентации белков происходит в клетках. Более 100 двойной целевых белков описаны для хлоропластов/пластид и митохондрий4и ряд белков, ориентированные на митохондрии и пероксисомы известны также5. Кроме того перебазирования белков под конкретные стимулы, например оксидативного стресса, является новой темой в ячейки биологии6. Таким образом местоположение белков необходимо рассматривать в контексте изучения биологии, и разнообразные подходы используются для определения и проверки месте2.

Митохондрии обычно изолированы от растительных тканей, гомогенизации, баланс между разорвать открыть клеточной стенки выпустить митохондрии, а не повреждение митохондрий. Традиционно картофель и цветная капуста, гомогенизации предполагает использование бытовой блендер/соковыжималка аппарат сделать жидкого экстракта в буфере с различными компонентами для поддержания активности. Изоляция митохондрий от гороха листья, (популярный материал для митохондриального изоляции с помощью молодых саженцев (~ 10 дней), использует blender для Лизируйте клетки, как лист материала мягкой. При наличии Arabidopsis thaliana T-ДНК инсерционному нокаут-линий необходимо иметь возможность очистить митохондрий выполнять функциональные исследования потребовало разработки методов изолировать митохондрий от лист, корень или цветок ткани. В целом методы, разработанные для других растений работал хорошо7, с приработок, измельчения материала необходимо оптимизировать. Для выращивания арабидопсиса это может быть достигнуто в различных способов (см. ниже) и отличается между типами ткани (корень против съемки). Использование непрерывного градиента также могут быть оптимизированы как плотность митохондрий от различных органов или этапы развития означает, что они могут перенести по-разному. Таким образом для максимального разделения плотность градиента можно усовершенствовать для достижения лучших разделения.

Однажды очищенный, митохондрии может использоваться для различных исследований, в том числе экспериментов усвоение белков и тРНК, анализов активность фермента, дыхательной цепи измерения и Вестерн-блот анализ. Изолированных митохондриях может также использоваться для анализа масс-спектрометрии белков изобилия. Целевые несколько реакции, мониторинг (MRM) анализ позволяет для количественной оценки определенных белков, но требуют значительных пробирного развития. В отличие от этого квантификация диметил или других изотопов этикетки8, обеспечивает открытие подход в выявлении различий через весь протеом, который может использоваться для выявления роман биологические исследования.

Protocol

Этот протокол используется для изоляции нетронутыми митохондрий от Arabidopsis thaliana органов, выращивается на земле, с помощью непрерывного коллоидных плотности градиенты. Все процедуры после сбора материала осуществляется на 4 ° C. 1. Подготовка шлифование средних, мыть бу…

Representative Results

Используя этот протокол, мы смогли обнаружить различные митохондриальных протеинов с SDS-PAGE и immunoblotting. Как показано на рисунке 3A, белок, изолированных от воды культуры ткани достаточно обнаружить слабые группы (2 мкг). Интенсивности сигнала увеличиваетс?…

Discussion

Как правило изоляции митохондрий от Arabidopsis листья урожайность до 3 мг митохондрий от примерно 80-100 3 – 4 – неделя старый растений, хотя урожайность более чем 5 мг часто может быть достигнуто с тщательного шлифования. Доходность зависит от условий роста и резко, как листья senesce, снижается, хот?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Австралийский исследовательский совет центра передового опыта в завод энергии биологии CE140100008, Австралийский исследовательский совет будущее стипендий (FT130100112) MWM и Феодор Линен стипендий (Александр фон Гумбольдт Фонд, Германия) для JS.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A2754 Chemical
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Chemical, dissolve in ethanol
AOX antibody from Tom Elthon Elthon et al., 1989
Ascorbate Sigma-Aldrich A0157 Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.
ATP Sigma-Aldrich A26209 Chemical
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSAS 1.0 Chemical
Clarity western ECL substrate Bio-Rad Laboratories 1705061 Chemical
Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells Bio-Rad Laboratories 5678104 Chemical
Cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Cytochrome c Sigma-Aldrich C3131 Chemical
Difco Agar, granulated BD Biosciences 214530 Chemical
Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632 Chemical
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich E5134 Chemical
Gamborg B-5 Basal Medium Austratec G398-100L Chemical
Gamborg Vitamin Solution (1000x) Austratec G219-100ML Chemical
Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706516-2ml Chemical
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706515-2ml Chemical
L-Cysteine Sigma C7352-100G Chemical
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 230391 Chemical
Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) Austratec M524-100L Chemical
Myxothiazol Sigma-Aldrich T5580 Chemical, dissolve in ethanol
NADH Sigma-Aldrich N8129 Chemical
Ndufs4 antibody from Etienne Meyer Meyer et al., 2009
n-Propyl gallate Sigma-Aldrich P3130 Chemical, dissolve in ethanol
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Chemical, colloidal density gradient
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Sigma-Aldrich PVP40 Chemical
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 Chemical
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Chemical
Sodium chloride Chem-Supply SA046 Chemical
Sodium dithionite Sigma-Aldrich 157953 Chemical
Sodium L-ascorbate Sigma A4034-100G Chemical
Succinate Sigma-Aldrich S2378 Chemical
Sucrose Chem-Supply SA030 Chemical
TES Sigma-Aldrich T1375 Chemical
Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) Sigma-Aldrich 221368 Chemical
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100 Chemical, detergent
Western Blocking Reagent Sigma 11921681001 Chemical
Balance Mettler Toledo XS204 Equipment
Beakers Isolab 50 mL
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-26XP Equipment
Centrifuge tubes Nalgene 3117-9500 Equipment
Circulator Julabo 1124971 Attached to oxygen electrode chamber
Conical flask Isolab 500 mL
Dropper 3 mL
Fixed angle rotor Beckman Coulter JA25.5 Equipment
Funnel Per Alimenti 14 cm For filtering
Gradient pourer Bio-Rad 165-4120 For preparation of gradients
Magnetic Stirrer ATE VELP Scientifica F20300165 Equipment
Miracloth VWR EM475855-1R Filtration material
Mortar and pestle Jamie Oliver Granite, 6 Inch Equipment
O2view Hansatech Instruments Oxygen monitoring software
Oxygraph Plus System Hansatech Instruments 1187253 Clark-type oxygen electrode
Paintbrush Artist first choice 1008R-12
Parafilm Bemis PM-996 plastic paraffin film
Peristaltic pump Gilson F155001 For preparation of gradients
PVC peristaltic tubing Gilson F117930 For preparation of gradients
Water bath VELP Scientifica OCB Equipment

References

  1. Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
  2. Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
  3. Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
  4. Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
  5. Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
  6. Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code – Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
  7. Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
  8. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
  9. Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
  10. Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
  11. Lee, C. P., Eubel, H., O’Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
  12. Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
  13. Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
  14. Peters, K., et al. Complex I – complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
  15. Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
  16. Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).

Play Video

Cite This Article
Lyu, W., Selinski, J., Li, L., Day, D. A., Murcha, M. W., Whelan, J., Wang, Y. Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (131), e56627, doi:10.3791/56627 (2018).

View Video