Summary

Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

Published: January 05, 2018
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Summary

Comme les mitochondries sont seulement un petit pourcentage de la cellule végétale, ils doivent être purifiés pour une série d’études. Les mitochondries peuvent être isolés dans divers organes de la plante par homogénéisation, suivie par centrifugation en gradient de différentiel et densité afin d’obtenir une fraction mitochondriale hautement purifiée.

Abstract

Les mitochondries sont des organites essentiels impliqués dans nombreuses voies métaboliques chez les plantes, notamment la production de l’adénosine triphosphate (ATP) de l’oxydation des composés réduits tels que la nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et la flavine adénine dinucléotide (FADH2). L’annotation complète du génome d’Arabidopsis thaliana a mis en place il comme plante modèle système le plus utilisé, et donc la nécessité de purifier les mitochondries des divers organes (feuilles, racines ou fleurs) est nécessaire pour utiliser pleinement les outils qui sont maintenant disponibles pour Arabidopsis étudier la biologie mitochondriale. Les mitochondries sont isolées par homogénéisation du tissu en utilisant une variété d’approches, suivie d’une série d’étapes de centrifugation différentielle produisant un granulé mitochondrial brut qui est ensuite purifiée à l’aide de gradient de densité colloïdal continue centrifugation. La matière colloïdale de densité est ensuite supprimée par plusieurs étapes de centrifugation. A partir de 100 g de tissus de la feuille fraîche, 2 à 3 mg de mitochondries peuvent être régulièrement obtenu. Respiratoires expériences sur ces mitochondries affichent les taux typiques de 100-250 nmol O2 min-1 mg de protéines mitochondriales total-1 (taux de NADH-dépendante) avec la possibilité d’utiliser divers substrats et inhibiteurs de déterminer quels substrats sont être oxydés et la capacité de l’alternative et cytochrome oxydases terminales. Ce protocole décrit une méthode d’isolement des mitochondries des feuilles d’Arabidopsis thaliana en utilisant des gradients de densité colloïdal continue et une mesure efficace respiratoire des mitochondries végétales purifiée.

Introduction

L’histoire de recherche mitochondriale plante remonte à plus de 100 ans1. Les mitochondries intactes ont été isolées pour la première dans les années 1950 en utilisant la centrifugation différentielle. Mitochondries à être purifié sans souffrir l’ajustement osmotique a permis l’avènement d’un gradient de densité colloïdales dans les années 1980. Tandis que les mitochondries purifiées dégradés ne conviennent pas pour la plupart des cas, en raison de la sensibilité de la spectrométrie de masse, contaminants même relativement mineures peuvent être détectés et peuvent être affectées indûment un emplacement mitochondrial2. L’utilisation de libre circulation électrophorèse peut enlever les deux plastidique et peroxysomes contamination3, mais libre écoulement électrophorèse est une technique hautement spécialisée et n’est pas requis pour la grande majorité des études. En outre, quand déterminer l’emplacement d’une protéine, qu’il faut rappeler que double ou multiple ciblant des protéines se produit dans les cellules. Plus de 100 doubles protéines ciblées sont décrits pour les chloroplastes/plastes et mitochondries4et un certain nombre de protéines ciblées aux mitochondries et peroxysomes sont également connus5. En outre, la re-localisation de protéines sous des stimuli spécifiques, par exemple le stress oxydatif, est un thème émergent dans la biologie cellulaire6. Ainsi, l’emplacement des protéines doit être examinée dans le contexte de la biologie a étudié, et une variété d’approches sont utilisées pour déterminer et vérifier l’emplacement2.

Les mitochondries sont généralement isolés des tissus végétaux par homogénéisation, il faut un équilibre entre rupture ouverte la paroi pour libérer les mitochondries et ne pas endommager les mitochondries. Traditionnellement, avec pommes de terre et chou-fleur, homogénéisation implique l’utilisation d’appareils ménagers blender/centrifugeuse pour faire un extrait liquide dans un tampon avec différents composants pour maintenir l’activité. Isolation des mitochondries de feuilles de pois, (un matériel populaire pour isolement mitochondriale à l’aide de jeunes plants (~ 10 jours), utilise un mélangeur pour lyser les cellules car le matériel de feuille est doux. Avec la disponibilité d’insertional knock out de Arabidopsis thaliana ADN-T, la nécessité d’être en mesure de purifier les mitochondries à réaliser des études fonctionnelles a nécessité l’élaboration de méthodes pour isoler les mitochondries des feuilles, racines ou fleurs tissus. Dans l’ensemble les méthodes mises au point pour les autres plantes a travaillé bien contre7, avec l’accessoire qui broyer du matériel nécessaire pour être optimisé. Pour Arabidopsis, cela peut être réalisé de diverses façons (voir ci-dessous) et diffère entre les types de tissus (racine contre shoot). L’utilisation du gradient continu peut également être optimisée comme la densité des mitochondries des différents organes ou stades moyens ils peuvent migrer différemment. Ainsi, pour séparation maximale, la densité du gradient peut être raffinée pour faire en sorte de réaliser la meilleure séparation.

Une fois purifié la mitochondrie peut être utilisée pour une variété d’études, y compris les expériences d’absorption de protéines et ARNt, tests d’activité enzymatique, chaîne respiratoire et buvardage de western. Mitochondries isolées peuvent également servir pour les analyses de la spectrométrie de masse de l’abondance de la protéine. Ciblé plusieurs réaction suivi des analyses (MRM) permet pour la quantification des définie des protéines, mais nécessitent le développement significatif de dosage. En revanche, quantification de diméthyle ou autres isotopes étiquettes8, fournit une approche de découverte dans l’identification des différences à travers le protéome entier qui peut être utilisé pour découvrir de nouveaux points de vue biologiques.

Protocol

Ce protocole est utilisé pour l’isolation des mitochondries intactes des organes d’Arabidopsis thaliana cultivées sur un sol à l’aide de gradients de densité colloïdal continue. Toutes les procédures après la collecte du matériel sont réalisés à 4 ° C. 1. préparation du tampon de Medium, lavage et Gradient Solutions de meulage Préparer 300 mL de broyage moyen (moins ascorbate et cystéine) et 200 mL de tampon de lavage x 2 après le tableau 1</str…

Representative Results

Utilisant ce protocole, nous avons été en mesure de détecter différentes protéines mitochondriales par SDS-PAGE et immunoblotting. Comme le montre la Figure 3 a, la protéine isolée du tissu de la culture de l’eau est suffisante pour détecter une faible bande (2 µg). Intensité du signal augmente proportionnellement aux montants chargés. Pour les mitochondries isolées des tissus cultivés sur des plaques (Figure 3 b),…

Discussion

En règle générale, isolation des mitochondries de l’Arabidopsis laisse rendements jusqu’à 3 mg de mitochondries d’environ 80-100 3 – 4 – semaine vieilles centrales, bien que les rendements de plus de 5 mg est possible souvent avec ponçage minutieux. Le rendement varie en fonction des conditions de croissance et diminue considérablement comme feuilles sénescentes, bien que la structure de la mitochondrie semble être bien entretenu au cours de la sénescence,9. Une des caractéristiques …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par un australien recherche Conseil Centre d’Excellence en usine énergie biologie CE140100008, une australienne Conseil avenir bourse de recherche (FT130100112) pour MWM et une bourse de recherche Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fondation, Allemagne) au JS.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A2754 Chemical
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Chemical, dissolve in ethanol
AOX antibody from Tom Elthon Elthon et al., 1989
Ascorbate Sigma-Aldrich A0157 Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.
ATP Sigma-Aldrich A26209 Chemical
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSAS 1.0 Chemical
Clarity western ECL substrate Bio-Rad Laboratories 1705061 Chemical
Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells Bio-Rad Laboratories 5678104 Chemical
Cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Cytochrome c Sigma-Aldrich C3131 Chemical
Difco Agar, granulated BD Biosciences 214530 Chemical
Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632 Chemical
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich E5134 Chemical
Gamborg B-5 Basal Medium Austratec G398-100L Chemical
Gamborg Vitamin Solution (1000x) Austratec G219-100ML Chemical
Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706516-2ml Chemical
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706515-2ml Chemical
L-Cysteine Sigma C7352-100G Chemical
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 230391 Chemical
Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) Austratec M524-100L Chemical
Myxothiazol Sigma-Aldrich T5580 Chemical, dissolve in ethanol
NADH Sigma-Aldrich N8129 Chemical
Ndufs4 antibody from Etienne Meyer Meyer et al., 2009
n-Propyl gallate Sigma-Aldrich P3130 Chemical, dissolve in ethanol
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Chemical, colloidal density gradient
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Sigma-Aldrich PVP40 Chemical
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 Chemical
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Chemical
Sodium chloride Chem-Supply SA046 Chemical
Sodium dithionite Sigma-Aldrich 157953 Chemical
Sodium L-ascorbate Sigma A4034-100G Chemical
Succinate Sigma-Aldrich S2378 Chemical
Sucrose Chem-Supply SA030 Chemical
TES Sigma-Aldrich T1375 Chemical
Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) Sigma-Aldrich 221368 Chemical
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100 Chemical, detergent
Western Blocking Reagent Sigma 11921681001 Chemical
Balance Mettler Toledo XS204 Equipment
Beakers Isolab 50 mL
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-26XP Equipment
Centrifuge tubes Nalgene 3117-9500 Equipment
Circulator Julabo 1124971 Attached to oxygen electrode chamber
Conical flask Isolab 500 mL
Dropper 3 mL
Fixed angle rotor Beckman Coulter JA25.5 Equipment
Funnel Per Alimenti 14 cm For filtering
Gradient pourer Bio-Rad 165-4120 For preparation of gradients
Magnetic Stirrer ATE VELP Scientifica F20300165 Equipment
Miracloth VWR EM475855-1R Filtration material
Mortar and pestle Jamie Oliver Granite, 6 Inch Equipment
O2view Hansatech Instruments Oxygen monitoring software
Oxygraph Plus System Hansatech Instruments 1187253 Clark-type oxygen electrode
Paintbrush Artist first choice 1008R-12
Parafilm Bemis PM-996 plastic paraffin film
Peristaltic pump Gilson F155001 For preparation of gradients
PVC peristaltic tubing Gilson F117930 For preparation of gradients
Water bath VELP Scientifica OCB Equipment

References

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Cite This Article
Lyu, W., Selinski, J., Li, L., Day, D. A., Murcha, M. W., Whelan, J., Wang, Y. Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (131), e56627, doi:10.3791/56627 (2018).

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