Summary

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

Published: January 05, 2018
doi:

Summary

כמו המיטוכונדריה הם רק אחוז קטן של תא צמח, הם צריכים טיהור למגוון רחב של מחקרים. המיטוכונדריה ניתן לבודד מתוך מגוון איברי הצמח על ידי המגון, ואחריו דיפרנציאלית וצפיפות צנטריפוגה מעבר צבע כדי לקבל חלק מיטוכונדריאלי נקיים במיוחד.

Abstract

המיטוכונדריה הם מעורבים מסלולים מטבוליים רבים בצמחים, בייחוד את הייצור של אדנוזין טריפוספט (ATP) מפני החמצון של תרכובות מופחתת כגון nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH), פלווין אדנין חיוניים organelles dinucleotide (FADH2). הביאור מלאה של הגנום תודרנית לבנה הקימה אותו כפי הנפוצים ביותר צמח מודל המערכת, ולכן הצורך לטהר את המיטוכונדריה ממגוון רחב של איברים (עלים, שורש או פרח) יש צורך לנצל במלואן את הכלים זה זמינות כעת עבור תודרנית ללמוד ביולוגיה מיטוכונדריאלי. המיטוכונדריה מבודדים המגון של הרקמה באמצעות מגוון של גישות, ואחריו שורה של צעדים צנטריפוגה דיפרנציאלית לייצר גלולה מיטוכונדריאלי גולמי זה נוסף מטוהרים באמצעות הדרגה צפיפות colloidal רציפה צנטריפוגה. Colloidal צפיפות החומר יוסר לאחר מכן על ידי מספר השלבים צנטריפוגה. החל מ- 100 גרם של רקמת העלה הטרי, 2-3 מ”ג של המיטוכונדריה ניתן באופן שגרתי להשיג. הנשימה ניסויים אלה המיטוכונדריה להציג שיעור טיפוסי של 100-250 nmol O2 דקות-1 מ”ג חלבון מיטוכונדריאלי סה כ-1 (תלויי-NADH שיעור) עם היכולת להשתמש מצעים שונים, מעכבי כדי לקבוע אילו מצעים הינם להיות מחומצן והיכולת של חלופה, ציטוכרום oxidases מסוף. פרוטוקול זה מתאר שיטה בידוד של המיטוכונדריה מן העלים תודרנית לבנה באמצעות מעברי צבע רציף צפיפות colloidal ומדידות יעיל הנשימה של הצמח מטוהרים המיטוכונדריה.

Introduction

ההיסטוריה של מחקר מיטוכונדריאלי הצמח חוזר מעל 100 שנה1. המיטוכונדריה שלם היו מבודדים לראשונה בתחילת שנות החמישים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. כניסתו של מעבר הדרגתי צפיפות colloidal בשנות ה-80 מותר המיטוכונדריה ולעצבנות ללא סבל osmotic ההתאמה. אמנם המיטוכונדריה מטוהרים הדרגתי מתאים לרוב המטרות, עקב הרגישות של ספקטרומטר מסה, אפילו יחסית ניתן להבחין וגורם לניתוקו עשויה להיות משויכת באופן בלתי הולם מיקום מיטוכונדריאלי2. שימוש של זרימה חופשית אלקטרופורזה יכולה להסיר את שניהם plastidic ו פראוקסיזום זיהום3, אבל חינם לזרום אלקטרופורזה היא טכניקה מאוד מיוחדים והוא לא נדרש עבור הרוב המכריע של מחקרים. יתר על כן, כאשר קביעת המיקום של חלבון שזה צריך להיות זכר את ליבה כפולה או פילוח מרובים של חלבונים מתרחש בתאים. מעל 100 חלבונים יישוב כפול מתוארים מהכלורופלסט/plastids, המיטוכונדריה4, מספר חלבונים ממוקד המיטוכונדריה, peroxisomes ידועים גם5. יתר על כן, המיקום מחדש של חלבונים תחת לגירויים ספציפיים, למשל סטרס חמצוני, הוא נושא המתעוררים תא ביולוגיה6. לפיכך, המיקום של חלבונים צריך להיחשב בהקשר של הביולוגיה למד, מגוון רחב של גישות משמשים כדי לקבוע ולאמת מיקום2.

המיטוכונדריה הם בדרך כלל מבודדים רקמות הצמח על ידי המגון, נדרש איזון בין לשבור קיר התא כדי לשחרר את המיטוכונדריה, לא מזיק המיטוכונדריה. באופן מסורתי, עם תפוחי אדמה, כרובית, המגון כולל באמצעות מכשירים ביתיים בלנדר/פאוואר להכין תמצית נוזלית במאגר עם רכיבים שונים כדי לשמור על פעילות. בידוד של המיטוכונדריה מן העלים אפונה, (חומר פופולרי מיטוכונדריאלי בידוד באמצעות שתילים צעירים (~ 10 ימים הישן), מנצל בלנדר כדי lyse תאים כמו החומר העלה הוא רך. עם הזמינות של תודרנית לבנה T-DNA insertional הנוק-אאוט קווים, הצורך להיות מסוגל לטהר את המיטוכונדריה לבצע מחקרים פונקציונלי יש המתחייבות בפיתוח שיטות כדי לבודד המיטוכונדריה עלים, שורש או פרח רקמות. בסך הכל השיטות שפותחו עבור צמחים אחרים עבד טוב7, עם הבונוס שחיקה של החומר צריך להיות מותאם. עבור תודרנית זה ניתן להשיג במגוון דרכים (ראו להלן), ו שונה בין סוגי רקמות (הבסיס לעומת לירות). ניתן למטב את השימוש במעבר מתמשך גם כמו הצפיפות של המיטוכונדריה של איברים שונים או שלבים התפתחותיים אומר שהם יכולים להעביר באופן שונה. לפיכך, להפרדה מקסימלית הצפיפות של מעבר הצבע יכול להיות מעודן כדי להבטיח כדי להשיג הפרדה הכי טוב.

פעם מטוהרים המיטוכונדריה יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים, כולל ניסויים ספיגת חלבונים ו tRNA, מבחני פעילות האנזים, שרשרת הנשימה מדידות וניתוחים תספיג חלבון. המיטוכונדריה מבודד יכול לשמש גם עבור ניתוחים ספקטרומטר מסה של חלבון שפע. יישוב התגובה מרובים ניטור ניתוחים (MRM) מאפשר כימות של המוגדר חלבונים, אך דורשים פיתוח משמעותי וזמינותו. לעומת זאת, כמת על ידי דימתיל או אחרים תוויות איזוטופ8, מספקת גישה גילוי בזיהוי ההבדלים על פני פרוטאום כל יכול לשמש כדי לחשוף תובנות ביולוגי הרומן.

Protocol

פרוטוקול זה משמש את ניתוקה של המיטוכונדריה ללא פגע מן האיברים תודרנית לבנה גדל על קרקע באמצעות מעברי צבע צפיפות colloidal רציפה. כל הליכים בעקבות אוסף המוזיאון של החומר, מתבצעות ב 4 º C. 1. הכנת השחזה מאגר בינוני, שטיפת ופתרונות הדרגתיות הכנת 300 מ של שיוף בינונית (מינוס ascor…

Representative Results

באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לזהות חלבונים מיטוכונדריאלי שונה על-ידי מרחביות-דף immunoblotting. כפי שמוצג באיור 3 א, חלבון מבודד מרקמות תרבות מים מספיקה לזהות להקה חלש (2 µg). עוצמת האות מגדילה באופן יחסי כמויות טעון. עבור המיטוכונדריה מבודד מן הרקמות גדל על ?…

Discussion

בדרך כלל, בידוד של המיטוכונדריה מ תודרנית יוצא תשואות עד 3 מ ג של המיטוכונדריה כ 80-100 3 – 4 – בן שבועיים צמחים, למרות התשואות של יותר מ 5 מ”ג לעיתים קרובות תושג עם טחינת יסודית. התשואה משתנה עם תנאי הגידול ומקטינות באופן דרמטי עלים senesce, למרות המיטוכונדריה מבנה שנראה טוב להישמר במהלך הזדקנות ביול?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי אוסטרליה מחקר המועצה מרכז של מצוינות הצמח אנרגיה הביולוגיה CE140100008, אוסטרליה מחקר המועצה העתיד לאגודה (FT130100112) MWM, פיודור Lynen מחקר לאגודה (אלכסנדר פון הומבולדט קרן, גרמניה) כדי JS.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A2754 Chemical
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Chemical, dissolve in ethanol
AOX antibody from Tom Elthon Elthon et al., 1989
Ascorbate Sigma-Aldrich A0157 Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.
ATP Sigma-Aldrich A26209 Chemical
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSAS 1.0 Chemical
Clarity western ECL substrate Bio-Rad Laboratories 1705061 Chemical
Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells Bio-Rad Laboratories 5678104 Chemical
Cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Cytochrome c Sigma-Aldrich C3131 Chemical
Difco Agar, granulated BD Biosciences 214530 Chemical
Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632 Chemical
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich E5134 Chemical
Gamborg B-5 Basal Medium Austratec G398-100L Chemical
Gamborg Vitamin Solution (1000x) Austratec G219-100ML Chemical
Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706516-2ml Chemical
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706515-2ml Chemical
L-Cysteine Sigma C7352-100G Chemical
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 230391 Chemical
Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) Austratec M524-100L Chemical
Myxothiazol Sigma-Aldrich T5580 Chemical, dissolve in ethanol
NADH Sigma-Aldrich N8129 Chemical
Ndufs4 antibody from Etienne Meyer Meyer et al., 2009
n-Propyl gallate Sigma-Aldrich P3130 Chemical, dissolve in ethanol
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Chemical, colloidal density gradient
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Sigma-Aldrich PVP40 Chemical
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 Chemical
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Chemical
Sodium chloride Chem-Supply SA046 Chemical
Sodium dithionite Sigma-Aldrich 157953 Chemical
Sodium L-ascorbate Sigma A4034-100G Chemical
Succinate Sigma-Aldrich S2378 Chemical
Sucrose Chem-Supply SA030 Chemical
TES Sigma-Aldrich T1375 Chemical
Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) Sigma-Aldrich 221368 Chemical
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100 Chemical, detergent
Western Blocking Reagent Sigma 11921681001 Chemical
Balance Mettler Toledo XS204 Equipment
Beakers Isolab 50 mL
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-26XP Equipment
Centrifuge tubes Nalgene 3117-9500 Equipment
Circulator Julabo 1124971 Attached to oxygen electrode chamber
Conical flask Isolab 500 mL
Dropper 3 mL
Fixed angle rotor Beckman Coulter JA25.5 Equipment
Funnel Per Alimenti 14 cm For filtering
Gradient pourer Bio-Rad 165-4120 For preparation of gradients
Magnetic Stirrer ATE VELP Scientifica F20300165 Equipment
Miracloth VWR EM475855-1R Filtration material
Mortar and pestle Jamie Oliver Granite, 6 Inch Equipment
O2view Hansatech Instruments Oxygen monitoring software
Oxygraph Plus System Hansatech Instruments 1187253 Clark-type oxygen electrode
Paintbrush Artist first choice 1008R-12
Parafilm Bemis PM-996 plastic paraffin film
Peristaltic pump Gilson F155001 For preparation of gradients
PVC peristaltic tubing Gilson F117930 For preparation of gradients
Water bath VELP Scientifica OCB Equipment

References

  1. Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
  2. Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
  3. Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
  4. Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
  5. Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
  6. Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code – Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
  7. Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
  8. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
  9. Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
  10. Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
  11. Lee, C. P., Eubel, H., O’Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
  12. Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
  13. Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
  14. Peters, K., et al. Complex I – complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
  15. Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
  16. Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).

Play Video

Cite This Article
Lyu, W., Selinski, J., Li, L., Day, D. A., Murcha, M. W., Whelan, J., Wang, Y. Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (131), e56627, doi:10.3791/56627 (2018).

View Video