בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה
Summary
כמו המיטוכונדריה הם רק אחוז קטן של תא צמח, הם צריכים טיהור למגוון רחב של מחקרים. המיטוכונדריה ניתן לבודד מתוך מגוון איברי הצמח על ידי המגון, ואחריו דיפרנציאלית וצפיפות צנטריפוגה מעבר צבע כדי לקבל חלק מיטוכונדריאלי נקיים במיוחד.
Abstract
המיטוכונדריה הם מעורבים מסלולים מטבוליים רבים בצמחים, בייחוד את הייצור של אדנוזין טריפוספט (ATP) מפני החמצון של תרכובות מופחתת כגון nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH), פלווין אדנין חיוניים organelles dinucleotide (FADH2). הביאור מלאה של הגנום תודרנית לבנה הקימה אותו כפי הנפוצים ביותר צמח מודל המערכת, ולכן הצורך לטהר את המיטוכונדריה ממגוון רחב של איברים (עלים, שורש או פרח) יש צורך לנצל במלואן את הכלים זה זמינות כעת עבור תודרנית ללמוד ביולוגיה מיטוכונדריאלי. המיטוכונדריה מבודדים המגון של הרקמה באמצעות מגוון של גישות, ואחריו שורה של צעדים צנטריפוגה דיפרנציאלית לייצר גלולה מיטוכונדריאלי גולמי זה נוסף מטוהרים באמצעות הדרגה צפיפות colloidal רציפה צנטריפוגה. Colloidal צפיפות החומר יוסר לאחר מכן על ידי מספר השלבים צנטריפוגה. החל מ- 100 גרם של רקמת העלה הטרי, 2-3 מ”ג של המיטוכונדריה ניתן באופן שגרתי להשיג. הנשימה ניסויים אלה המיטוכונדריה להציג שיעור טיפוסי של 100-250 nmol O2 דקות-1 מ”ג חלבון מיטוכונדריאלי סה כ-1 (תלויי-NADH שיעור) עם היכולת להשתמש מצעים שונים, מעכבי כדי לקבוע אילו מצעים הינם להיות מחומצן והיכולת של חלופה, ציטוכרום oxidases מסוף. פרוטוקול זה מתאר שיטה בידוד של המיטוכונדריה מן העלים תודרנית לבנה באמצעות מעברי צבע רציף צפיפות colloidal ומדידות יעיל הנשימה של הצמח מטוהרים המיטוכונדריה.
Introduction
ההיסטוריה של מחקר מיטוכונדריאלי הצמח חוזר מעל 100 שנה1. המיטוכונדריה שלם היו מבודדים לראשונה בתחילת שנות החמישים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. כניסתו של מעבר הדרגתי צפיפות colloidal בשנות ה-80 מותר המיטוכונדריה ולעצבנות ללא סבל osmotic ההתאמה. אמנם המיטוכונדריה מטוהרים הדרגתי מתאים לרוב המטרות, עקב הרגישות של ספקטרומטר מסה, אפילו יחסית ניתן להבחין וגורם לניתוקו עשויה להיות משויכת באופן בלתי הולם מיקום מיטוכונדריאלי2. שימוש של זרימה חופשית אלקטרופורזה יכולה להסיר את שניהם plastidic ו פראוקסיזום זיהום3, אבל חינם לזרום אלקטרופורזה היא טכניקה מאוד מיוחדים והוא לא נדרש עבור הרוב המכריע של מחקרים. יתר על כן, כאשר קביעת המיקום של חלבון שזה צריך להיות זכר את ליבה כפולה או פילוח מרובים של חלבונים מתרחש בתאים. מעל 100 חלבונים יישוב כפול מתוארים מהכלורופלסט/plastids, המיטוכונדריה4, מספר חלבונים ממוקד המיטוכונדריה, peroxisomes ידועים גם5. יתר על כן, המיקום מחדש של חלבונים תחת לגירויים ספציפיים, למשל סטרס חמצוני, הוא נושא המתעוררים תא ביולוגיה6. לפיכך, המיקום של חלבונים צריך להיחשב בהקשר של הביולוגיה למד, מגוון רחב של גישות משמשים כדי לקבוע ולאמת מיקום2.
המיטוכונדריה הם בדרך כלל מבודדים רקמות הצמח על ידי המגון, נדרש איזון בין לשבור קיר התא כדי לשחרר את המיטוכונדריה, לא מזיק המיטוכונדריה. באופן מסורתי, עם תפוחי אדמה, כרובית, המגון כולל באמצעות מכשירים ביתיים בלנדר/פאוואר להכין תמצית נוזלית במאגר עם רכיבים שונים כדי לשמור על פעילות. בידוד של המיטוכונדריה מן העלים אפונה, (חומר פופולרי מיטוכונדריאלי בידוד באמצעות שתילים צעירים (~ 10 ימים הישן), מנצל בלנדר כדי lyse תאים כמו החומר העלה הוא רך. עם הזמינות של תודרנית לבנה T-DNA insertional הנוק-אאוט קווים, הצורך להיות מסוגל לטהר את המיטוכונדריה לבצע מחקרים פונקציונלי יש המתחייבות בפיתוח שיטות כדי לבודד המיטוכונדריה עלים, שורש או פרח רקמות. בסך הכל השיטות שפותחו עבור צמחים אחרים עבד טוב7, עם הבונוס שחיקה של החומר צריך להיות מותאם. עבור תודרנית זה ניתן להשיג במגוון דרכים (ראו להלן), ו שונה בין סוגי רקמות (הבסיס לעומת לירות). ניתן למטב את השימוש במעבר מתמשך גם כמו הצפיפות של המיטוכונדריה של איברים שונים או שלבים התפתחותיים אומר שהם יכולים להעביר באופן שונה. לפיכך, להפרדה מקסימלית הצפיפות של מעבר הצבע יכול להיות מעודן כדי להבטיח כדי להשיג הפרדה הכי טוב.
פעם מטוהרים המיטוכונדריה יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים, כולל ניסויים ספיגת חלבונים ו tRNA, מבחני פעילות האנזים, שרשרת הנשימה מדידות וניתוחים תספיג חלבון. המיטוכונדריה מבודד יכול לשמש גם עבור ניתוחים ספקטרומטר מסה של חלבון שפע. יישוב התגובה מרובים ניטור ניתוחים (MRM) מאפשר כימות של המוגדר חלבונים, אך דורשים פיתוח משמעותי וזמינותו. לעומת זאת, כמת על ידי דימתיל או אחרים תוויות איזוטופ8, מספקת גישה גילוי בזיהוי ההבדלים על פני פרוטאום כל יכול לשמש כדי לחשוף תובנות ביולוגי הרומן.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדרך כלל, בידוד של המיטוכונדריה מ תודרנית יוצא תשואות עד 3 מ ג של המיטוכונדריה כ 80-100 3 – 4 – בן שבועיים צמחים, למרות התשואות של יותר מ 5 מ”ג לעיתים קרובות תושג עם טחינת יסודית. התשואה משתנה עם תנאי הגידול ומקטינות באופן דרמטי עלים senesce, למרות המיטוכונדריה מבנה שנראה טוב להישמר במהלך הזדקנות ביול?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי אוסטרליה מחקר המועצה מרכז של מצוינות הצמח אנרגיה הביולוגיה CE140100008, אוסטרליה מחקר המועצה העתיד לאגודה (FT130100112) MWM, פיודור Lynen מחקר לאגודה (אלכסנדר פון הומבולדט קרן, גרמניה) כדי JS.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code – Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O’Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I – complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
