Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana
Summary
Como as mitocôndrias são apenas uma pequena percentagem da célula vegetal, eles precisam ser purificado para uma gama de estudos. Mitocôndrias podem ser isoladas em uma variedade de órgãos da planta por homogeneização, seguida de centrifugação gradiente diferencial e densidade para obter uma fração mitocondrial altamente purificada.
Abstract
As mitocôndrias são organelas essenciais envolvidos em diversas vias metabólicas nas plantas, mais notavelmente a produção de adenosina trifosfato (ATP) a partir da oxidação de compostos reduzidos como o dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADH) e adenina flavina dinucleótido (DANIII2). A anotação completa do genoma de Arabidopsis thaliana tem estabelecido como o mais amplamente utilizado sistema modelo de planta, e assim a necessidade de purificar a mitocôndria de uma variedade de órgãos (folha, raiz ou flor) é necessária utilizar plenamente as ferramentas que estão agora disponíveis para Arabidopsis estudar Biologia mitocondrial. As mitocôndrias são isoladas por homogeneização do tecido usando uma variedade de abordagens, seguido por uma série de etapas de centrifugação diferencial, produzindo uma pelota mitocondrial bruta que é ainda mais purificada usando gradiente de densidade colloidal contínua centrifugação. O material de densidade coloidal é posteriormente removido por várias etapas de centrifugação. A partir de 100 g de tecido foliar fresco, 2-3 mg de mitocôndrias pode ser rotineiramente obtido. Experiências respiratórias com essas mitocôndrias exibir as taxas típicas de 100-250 nmol O2 min-1 mg proteína mitocondrial total-1 (taxa de NADH-dependente) com a capacidade de usar diferentes substratos e inibidores para determinar quais substratos estão sendo oxidados e a capacidade das alternativa e citocromo oxidases terminais. Este protocolo descreve um método de isolamento de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana folhas usando gradientes de densidade colloidal contínua e uma eficiente medições respiratória de mitocôndrias de plantas purificada.
Introduction
A história da pesquisa mitocondrial planta remonta a mais de 100 anos1. Mitocôndrias intactas foram primeiramente isoladas no início de 1950 usando centrifugação diferencial. O advento de um gradiente de densidade coloidal na década de 1980 permitiu a mitocôndria ser purificado sem sofrer ajuste osmótico. Enquanto as mitocôndrias purificadas gradientes são adequadas para os fins mais, devido à sensibilidade de espectrometria de massa, mesmo relativamente menores contaminantes podem ser detectados e podem ser inadequadamente atribuídos uma localização mitocondrial2. O uso de fluxo livre eletroforese pode remover ambos plastidic e Peroxissoma contaminação3, mas o livre fluxo de electroforese é uma técnica altamente especializada e não é necessária para a grande maioria dos estudos. Além disso, quando determinar a localização de uma proteína que precisa ser lembrado que dupla ou múltipla segmentação das proteínas ocorre nas células. Mais de 100 proteínas alvo duplas são descritas por cloroplastos/plastídios e mitocôndrias4e um número de proteínas direcionados para mitocôndrias e peroxissomos são também conhecidos5. Além disso, a re-localização de proteínas sob estímulos específicos, por exemplo, estresse oxidativo, é um tema emergente na célula biologia6. Assim, a localização de proteínas precisa ser considerado no contexto da biologia estudou, e uma variedade de abordagens são usadas para determinar e verificar o local2.
As mitocôndrias são tipicamente isoladas de tecidos vegetais por homogeneização, um equilíbrio é necessário entre quebrar aberto a parede celular para liberar as mitocôndrias e não danificar as mitocôndrias. Tradicionalmente, com batata e couve-flor, homogeneização envolve o uso de aparelhos domésticos de liquidificador/espremedor para fazer um extrato líquido em um buffer com vários componentes para manter a atividade. Isolamento de mitocôndrias de folhas de ervilha, (um material popular para isolamento mitocondrial usando mudas jovens (~ 10 dias de idade), utiliza um liquidificador para lyse pilhas como o material da folha é macio. Com a disponibilidade de linhas de nocaute insercional Arabidopsis thaliana T-DNA, a necessidade de ser capaz de purificar as mitocôndrias para realizar estudos funcionais exigiu o desenvolvimento de métodos para isolar mitocôndrias de folha, raiz ou flor tecido. No geral, os métodos desenvolvidos para outras plantas trabalharam bem7, com a gratificação que moagem do material necessário para ser otimizado. Para Arabidopsis, isto pode ser alcançado em uma variedade de maneiras (veja abaixo) e difere entre os tipos de tecido (raiz contra atirar). O uso do gradiente contínuo também pode ser otimizado como a densidade de mitocôndrias de diferentes órgãos ou fases do desenvolvimento, eles podem migrar de forma diferente. Assim, para a separação máxima a densidade do gradiente pode ser refinada para garantir para alcançar a melhor separação.
Uma vez purificado a mitocôndria pode ser usada para uma variedade de estudos, incluindo experimentos de absorção de proteína e tRNA, ensaios de atividade enzimática, borrão ocidental análises e medições de cadeia respiratória. Mitocôndrias isoladas também podem ser usadas para análise de espectrometria de massa da abundância de proteína. Alvo de reação múltiplas análises (MRM) de monitoramento permite a quantificação de definidas proteínas, mas exigem o desenvolvimento significativo do ensaio. Em contraste, quantificação de dimetil ou outros rótulos de isótopo8, fornece uma abordagem de descoberta em identificar diferenças entre o proteome inteiro que pode ser usado para descobrir novos insights biológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Normalmente, isolamento de mitocôndrias de Arabidopsis deixa rendimentos acima de 3 mg de mitocôndrias de aproximadamente 80-100 3 – 4 semana de idade plantas, embora rendimentos superiores a 5 mg, muitas vezes podem ser alcançados com moagem completa. O rendimento varia com as condições de crescimento e diminui drasticamente, como deixa senesce, embora as mitocôndrias estrutura parece ser bem conservado durante a senescência9. Uma das características mais importantes para obter um bom ren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado por um australiano Conselho centro de excelência em pesquisa na planta de energia CE140100008 de biologia, um australiano Conselho futuro bolsa de pesquisa (FT130100112) para MWM e uma bolsa de pesquisa Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fundação, Alemanha) de JS.
Materials
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
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