Summary

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Published: January 05, 2018
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Summary

Como as mitocôndrias são apenas uma pequena percentagem da célula vegetal, eles precisam ser purificado para uma gama de estudos. Mitocôndrias podem ser isoladas em uma variedade de órgãos da planta por homogeneização, seguida de centrifugação gradiente diferencial e densidade para obter uma fração mitocondrial altamente purificada.

Abstract

As mitocôndrias são organelas essenciais envolvidos em diversas vias metabólicas nas plantas, mais notavelmente a produção de adenosina trifosfato (ATP) a partir da oxidação de compostos reduzidos como o dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADH) e adenina flavina dinucleótido (DANIII2). A anotação completa do genoma de Arabidopsis thaliana tem estabelecido como o mais amplamente utilizado sistema modelo de planta, e assim a necessidade de purificar a mitocôndria de uma variedade de órgãos (folha, raiz ou flor) é necessária utilizar plenamente as ferramentas que estão agora disponíveis para Arabidopsis estudar Biologia mitocondrial. As mitocôndrias são isoladas por homogeneização do tecido usando uma variedade de abordagens, seguido por uma série de etapas de centrifugação diferencial, produzindo uma pelota mitocondrial bruta que é ainda mais purificada usando gradiente de densidade colloidal contínua centrifugação. O material de densidade coloidal é posteriormente removido por várias etapas de centrifugação. A partir de 100 g de tecido foliar fresco, 2-3 mg de mitocôndrias pode ser rotineiramente obtido. Experiências respiratórias com essas mitocôndrias exibir as taxas típicas de 100-250 nmol O2 min-1 mg proteína mitocondrial total-1 (taxa de NADH-dependente) com a capacidade de usar diferentes substratos e inibidores para determinar quais substratos estão sendo oxidados e a capacidade das alternativa e citocromo oxidases terminais. Este protocolo descreve um método de isolamento de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana folhas usando gradientes de densidade colloidal contínua e uma eficiente medições respiratória de mitocôndrias de plantas purificada.

Introduction

A história da pesquisa mitocondrial planta remonta a mais de 100 anos1. Mitocôndrias intactas foram primeiramente isoladas no início de 1950 usando centrifugação diferencial. O advento de um gradiente de densidade coloidal na década de 1980 permitiu a mitocôndria ser purificado sem sofrer ajuste osmótico. Enquanto as mitocôndrias purificadas gradientes são adequadas para os fins mais, devido à sensibilidade de espectrometria de massa, mesmo relativamente menores contaminantes podem ser detectados e podem ser inadequadamente atribuídos uma localização mitocondrial2. O uso de fluxo livre eletroforese pode remover ambos plastidic e Peroxissoma contaminação3, mas o livre fluxo de electroforese é uma técnica altamente especializada e não é necessária para a grande maioria dos estudos. Além disso, quando determinar a localização de uma proteína que precisa ser lembrado que dupla ou múltipla segmentação das proteínas ocorre nas células. Mais de 100 proteínas alvo duplas são descritas por cloroplastos/plastídios e mitocôndrias4e um número de proteínas direcionados para mitocôndrias e peroxissomos são também conhecidos5. Além disso, a re-localização de proteínas sob estímulos específicos, por exemplo, estresse oxidativo, é um tema emergente na célula biologia6. Assim, a localização de proteínas precisa ser considerado no contexto da biologia estudou, e uma variedade de abordagens são usadas para determinar e verificar o local2.

As mitocôndrias são tipicamente isoladas de tecidos vegetais por homogeneização, um equilíbrio é necessário entre quebrar aberto a parede celular para liberar as mitocôndrias e não danificar as mitocôndrias. Tradicionalmente, com batata e couve-flor, homogeneização envolve o uso de aparelhos domésticos de liquidificador/espremedor para fazer um extrato líquido em um buffer com vários componentes para manter a atividade. Isolamento de mitocôndrias de folhas de ervilha, (um material popular para isolamento mitocondrial usando mudas jovens (~ 10 dias de idade), utiliza um liquidificador para lyse pilhas como o material da folha é macio. Com a disponibilidade de linhas de nocaute insercional Arabidopsis thaliana T-DNA, a necessidade de ser capaz de purificar as mitocôndrias para realizar estudos funcionais exigiu o desenvolvimento de métodos para isolar mitocôndrias de folha, raiz ou flor tecido. No geral, os métodos desenvolvidos para outras plantas trabalharam bem7, com a gratificação que moagem do material necessário para ser otimizado. Para Arabidopsis, isto pode ser alcançado em uma variedade de maneiras (veja abaixo) e difere entre os tipos de tecido (raiz contra atirar). O uso do gradiente contínuo também pode ser otimizado como a densidade de mitocôndrias de diferentes órgãos ou fases do desenvolvimento, eles podem migrar de forma diferente. Assim, para a separação máxima a densidade do gradiente pode ser refinada para garantir para alcançar a melhor separação.

Uma vez purificado a mitocôndria pode ser usada para uma variedade de estudos, incluindo experimentos de absorção de proteína e tRNA, ensaios de atividade enzimática, borrão ocidental análises e medições de cadeia respiratória. Mitocôndrias isoladas também podem ser usadas para análise de espectrometria de massa da abundância de proteína. Alvo de reação múltiplas análises (MRM) de monitoramento permite a quantificação de definidas proteínas, mas exigem o desenvolvimento significativo do ensaio. Em contraste, quantificação de dimetil ou outros rótulos de isótopo8, fornece uma abordagem de descoberta em identificar diferenças entre o proteome inteiro que pode ser usado para descobrir novos insights biológicas.

Protocol

Este protocolo é usado para a isolação de mitocôndrias intactas de órgãos de Arabidopsis thaliana cultivadas em solo usando gradientes de densidade colloidal contínua. A coleta do material a seguir todos os procedimentos são realizados a 4 ° C. 1. preparação de moagem média, Wash Buffer e soluções de gradientes Preparar 300 mL de moagem média (menos ascorbato e cisteína) e 200 mL de tampão de lavagem 2 x por tabela 1 um dia antes do isolamen…

Representative Results

Usando este protocolo, fomos capazes de detectar diferentes proteínas mitocondriais por SDS-PAGE e immunoblotting. Como mostrado na Figura 3A, a proteína isolada do tecido de cultura de água é suficiente para detectar uma banda fraca (2 µ g). Intensidade do sinal aumenta proporcionalmente aos montantes carregados. Por mitocôndrias isoladas de tecidos cultivados em placas (Figura 3B), a resposta ao estresse de luz alta o tra…

Discussion

Normalmente, isolamento de mitocôndrias de Arabidopsis deixa rendimentos acima de 3 mg de mitocôndrias de aproximadamente 80-100 3 – 4 semana de idade plantas, embora rendimentos superiores a 5 mg, muitas vezes podem ser alcançados com moagem completa. O rendimento varia com as condições de crescimento e diminui drasticamente, como deixa senesce, embora as mitocôndrias estrutura parece ser bem conservado durante a senescência9. Uma das características mais importantes para obter um bom ren…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi suportado por um australiano Conselho centro de excelência em pesquisa na planta de energia CE140100008 de biologia, um australiano Conselho futuro bolsa de pesquisa (FT130100112) para MWM e uma bolsa de pesquisa Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fundação, Alemanha) de JS.

Materials

ADP Sigma-Aldrich A2754 Chemical
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Chemical, dissolve in ethanol
AOX antibody from Tom Elthon Elthon et al., 1989
Ascorbate Sigma-Aldrich A0157 Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.
ATP Sigma-Aldrich A26209 Chemical
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSAS 1.0 Chemical
Clarity western ECL substrate Bio-Rad Laboratories 1705061 Chemical
Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells Bio-Rad Laboratories 5678104 Chemical
Cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Cytochrome c Sigma-Aldrich C3131 Chemical
Difco Agar, granulated BD Biosciences 214530 Chemical
Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632 Chemical
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich E5134 Chemical
Gamborg B-5 Basal Medium Austratec G398-100L Chemical
Gamborg Vitamin Solution (1000x) Austratec G219-100ML Chemical
Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706516-2ml Chemical
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706515-2ml Chemical
L-Cysteine Sigma C7352-100G Chemical
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 230391 Chemical
Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) Austratec M524-100L Chemical
Myxothiazol Sigma-Aldrich T5580 Chemical, dissolve in ethanol
NADH Sigma-Aldrich N8129 Chemical
Ndufs4 antibody from Etienne Meyer Meyer et al., 2009
n-Propyl gallate Sigma-Aldrich P3130 Chemical, dissolve in ethanol
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Chemical, colloidal density gradient
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Sigma-Aldrich PVP40 Chemical
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 Chemical
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Chemical
Sodium chloride Chem-Supply SA046 Chemical
Sodium dithionite Sigma-Aldrich 157953 Chemical
Sodium L-ascorbate Sigma A4034-100G Chemical
Succinate Sigma-Aldrich S2378 Chemical
Sucrose Chem-Supply SA030 Chemical
TES Sigma-Aldrich T1375 Chemical
Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) Sigma-Aldrich 221368 Chemical
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100 Chemical, detergent
Western Blocking Reagent Sigma 11921681001 Chemical
Balance Mettler Toledo XS204 Equipment
Beakers Isolab 50 mL
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-26XP Equipment
Centrifuge tubes Nalgene 3117-9500 Equipment
Circulator Julabo 1124971 Attached to oxygen electrode chamber
Conical flask Isolab 500 mL
Dropper 3 mL
Fixed angle rotor Beckman Coulter JA25.5 Equipment
Funnel Per Alimenti 14 cm For filtering
Gradient pourer Bio-Rad 165-4120 For preparation of gradients
Magnetic Stirrer ATE VELP Scientifica F20300165 Equipment
Miracloth VWR EM475855-1R Filtration material
Mortar and pestle Jamie Oliver Granite, 6 Inch Equipment
O2view Hansatech Instruments Oxygen monitoring software
Oxygraph Plus System Hansatech Instruments 1187253 Clark-type oxygen electrode
Paintbrush Artist first choice 1008R-12
Parafilm Bemis PM-996 plastic paraffin film
Peristaltic pump Gilson F155001 For preparation of gradients
PVC peristaltic tubing Gilson F117930 For preparation of gradients
Water bath VELP Scientifica OCB Equipment

References

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Cite This Article
Lyu, W., Selinski, J., Li, L., Day, D. A., Murcha, M. W., Whelan, J., Wang, Y. Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (131), e56627, doi:10.3791/56627 (2018).

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