Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi<em> Drosophila</em> Motor Nöron Dejenerasyonu
Summary
Burada, Drosophila larva'daki segmental sinirlere zarar vermek için basit ve yaygın olarak erişilebilen bir yöntem tarif ediyor ve üçüncü instar larva nöromüsküler kavşakta (NMJ) motor nöronların nörodejenerasyonunu görselleştirip sayısallaştırıyor.
Abstract
Nöronların dejenerasyonu normal gelişim sırasında, yaralanma, stres ve hastalığa yanıt olarak ortaya çıkar. Nöronal dejenerasyonun hücresel özellikleri, insanlarda ve omurgasızlarda bu işlemleri yönlendiren moleküler mekanizmalarda olduğu gibi oldukça benzerdir. Meyve sinek, Drosophila melanogaster , nörodejeneratif hastalıkların hücresel karmaşıklıklarını incelemek için güçlü ama basit bir genetik model organizması sağlar. Nitekim, hastalıkla ilişkili insan genlerinin yaklaşık% 70'inde bir Drosophila homologu vardır ve çok sayıda alet ve tahliller, insan nörodejeneratif hastalıklarını incelemek için sinekler kullanılarak tarif edilmiştir. Daha spesifik olarak, Drosophila'daki nöromüsküler kavşak (NMJ), nöron ile kas arasındaki yapısal bağlantıları analiz etme kabiliyeti nedeniyle nöromüsküler hastalıkları incelemek için etkili bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Burada, Drosophila'daki bir in vivo motor nöron hasarı tayini üzerinde rapor veriyoruz;NMJ'de 24 saat nörodejenerasyonu uyarılabilir şekilde uyarır. Bu metodolojiyi kullanarak, motor nöron dejenerasyonuna neden olan hücresel olayların geçici bir dizisini açıkladık. Hasar yöntemi, çeşitli uygulamalar içerir ve ayrıca nörodejenerasyon için gerekli spesifik genleri tanımlamak ve nöronal hasara transkripsiyonel cevapları incelemek için kullanılmıştır.
Introduction
Nöronal dejenerasyon normal gelişim sırasında oluşur ve doğal yaşlanma süreci, yaralanma, stres veya hastalık durumlarından kaynaklanabilir. Ortak meyve sineği olan Drosophila melanogaster , nöronların dejenerasyonunu yönlendiren moleküler mekanizmalardaki olağanüstü benzerliklerden dolayı nörodejenerasyonu incelemek için basit ve güçlü bir model organizması sağlar. Bu benzerlikler, hastalıkla ilişkili insan genlerinin yaklaşık% 70'inde bir Drosophila homologunun varlığı ile vurgulanır. 1 Ek olarak, sayısız deneyleri ve insan nörodejeneratif hastalıklar çalışma teknolojik araçlar geliştirilmiştir ve Drosophilia'daki kullanılmıştır. 2, Drosophila içinde 3, nöro-musküler eklem (NMJ) hem hücresel hem de elektrofizyolojik özelliklerin analizi için izin veriyor ve görünür n nöromüsküler hastalığı araştırmak için önemli bir sistem olduğu kanıtlanmıştırEuron-kas bağlantıları. 2 Bu çalışmada, segmental sinirlerin tekrarlanabilir yaralanmasına izin veren Drosophila larvalarında bir in vivo nöron hasar analizini açıkladık. Bu motonöron yaralanması, yaralanmadan 24 saat sonra NMJ'de nörodejenerasyona neden olan hücresel olayların zamansal bir dizilimiyle sonuçlanır. Nörodejenerasyonla sonuçlanan tekrarlanabilir yaralanma motoneuronları yeteneği, dejeneratif işlem için gerekli spesifik genlerin belirlenmesi, nöronal hasara transkripsiyonel cevapların diseksiyonu ve koruyucu sinyalleme çağlayanlarının analizi gibi farklı uygulamalar içerir. 4 , 5 , 6 Bu yöntem aynı zamanda canlı hayvanlarda nöronal dejenerasyon ve yenilenmeyi incelemek için mikroakışkanlarla birlikte kullanılmıştır. 7
Motor nöron dejeneratını incelemek için kurulan niceliksel bir tahlilden yararlanıyoruzIyonu mekanik yaralanma sonrası Drosophila NMJ'de. Bu tahlil, presinaptik zar ve proteinlerin kaybedilmesinin, postsınaptik kas membranı kıvrımlarıyla karakterize edilen subsynaptik retikulumun (SSR) sökülmesinden önce gelmesi üzerine kuruludur. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Bu tahlil, pre-sinaptik nöronun bitişik postsinaptik kas ile olan bağlantısını kaybettiği "sinaptik ayak izlerinin" ölçülmesine izin verir. Dejeneratif sürecin larva gelişimi boyunca ilerici olduğu gösterilmiştir 12 ve değişen sinaps gelişimi veya filizlenmesiyle açıklanamaz. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ReklamMevcut mutasyonlar üzerine mekanik yaralanma kullanmanın avantajı, NMJ'de nörodejenerasyona yol açan hücresel olayların geçici diziliminin parçalanmasına izin vermesidir. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
Daha önce tarif edilen ve burada gösterilen nöronal mekanik yaralanma, Drosophila larvalarının segmental sinirlerinde hasar / stres yaratmak için kullanılabilir. 4 , 5 , 6 , 14 Bu deneysel teknik, yaralanmadan sonra motor nöron hücre cisimciklerinde transkripsiyonel değişikliklerin incelenmesinin yanı sıra nörodejenerasyona yol açan olayların zamansal dizilimini incele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quinnipiac Üniversitesi'ndeki Keller ve Magie Labs'ın tüm üyelerine yararlı öneriler için teşekkür ederiz. Özellikle, Keller Laboratuarı'nda bu hasar analizinin geliştirilmesi için Barron L. Lincoln II'ye teşekkür etmek isteriz. LC Keller'e ödül verilen Quinnipiac Üniversitesi Sanat ve Bilim Hukuku Yüksek Okuluna teşekkür ederiz.
Materials
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased/ |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).
- . Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
