פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em> תסיסנית</em> נוירון מוטון ניוון
Summary
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ונגישה באופן נרחב לפגוע עצבים סגמנטליים בזחלים תסיסנית לדמיין לכמת neurodegeneration של נוירונים המנוע בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחלים instar השלישי.
Abstract
ניוון של נוירונים מתרחשת במהלך התפתחות נורמלית בתגובה על פגיעה, מתח, מחלה. סימפטומים הסלולר של התנוונות העצבית דומים להפליא אצל בני אדם וחסרי חוליות כמו המנגנונים המולקולריים המניעים תהליכים אלה. זבוב הפירות, תסיסנית melanogaster , מספק אורגניזם מודל גנטי פשוט אך פשוט כדי לחקור את המורכבות הסלולרית של מחלות נוירודגנרטיבי. למעשה, כ 70% מכלל גנים אנושיים הקשורים למחלה יש homolog דרוזופילה וכן שפע של כלי מבחנים תוארו באמצעות זבובים כדי לחקור מחלות ניווניות אנושיות. באופן ספציפי יותר הצומת neuromuscular (NMJ) ב תסיסנית הוכיחה להיות מערכת יעילה ללמוד מחלות neuromuscular בגלל היכולת לנתח את הקשרים המבניים בין הנוירון לשריר. הנה, אנו מדווחים על vivo המנוע assay פגיעה נוירון תסיסנית , אשרReproducibly גורם neurodegeneration ב NMJ על ידי 24 שעות. באמצעות מתודולוגיה זו, תיארנו רצף זמני של אירועים סלולריים וכתוצאה מכך ניוון נוירונים מוטוריים. שיטת הפציעה יש יישומים מגוונים יש גם נוצלו כדי לזהות גנים ספציפיים הדרושים neurodegeneration ו לנתח תגובות תמליל לפציעה העצבית.
Introduction
ניוון עצבי מתרחשת במהלך התפתחות נורמלית יכול להיגרם על ידי תהליך ההזדקנות הטבעי, פציעה, מתח, או מצבי מחלה. תסיסנית melanogaster , זבוב הפירות המשותף, מספק אורגניזם מודל פשוט וחזק ללמוד neurodegeneration בשל הדמיון המדהים של המנגנונים המולקולריים המניעים את התנוונות של נוירונים. קווי דמיון אלה מודגשים על ידי העובדה כי כ -70% של גנים אנושיים הקשורים המחלה יש הומולוג תסיסנית . 1 בנוסף, מבחני רבים וכלים טכנולוגיים ללמוד מחלות נוירודגנרטיביות אנושית פותחו וניצל תסיסנית . 2 , 3 בתוך תסיסנית , צומת neuromuscular (NMJ) מאפשר ניתוח של תכונות הסלולר והן אלקטרופיזיולוגיים הוכיח להיות מערכת חשובה ללמוד מחלות neuromuscular בשל n גלויחיבורי שריר יורון. 2 במחקר זה, אנו מתארים את assay פגיעה vivo נוירון בזחלים תסיסנית המאפשר הפציעה לשחזור של עצבים סגמנטליים. זו פגיעה motoneuron התוצאות ברצף הזמני של אירועים סלולריים וכתוצאה מכך neurodegeneration ב NMJ 24 שעות לאחר הפציעה. היכולת לשכפל מוטורונורונים פגמים וכתוצאה מכך neurodegeneration יש יישומים מגוונים כגון זיהוי גנים ספציפיים הנדרשים לתהליך ניוונית, דיסקציה של תגובות תעתיק פציעה עצבית, וניתוח של מפלים איתות מגן. 4 , 5 , 6 שיטה זו שימשה גם בשילוב עם microfluidics ללמוד ניוון העצב התחדשות בבעלי חיים. 7
אנו מנצלים assay כמותי הוקמה לבחון degenerat נוירון המנועיון ב NMJ תסיסנית לאחר פגיעה מכנית. Assay זה מבוסס על העובדה כי אובדן של קרום presynaptic וחלבונים קודמת פירוק של reticulum subsynaptic (SSR) המאופיינת על ידי foldynaptic קרום שרירי הקפלים. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 assay זה מאפשר כימות של "טביעות רגליים סינפטי" שבו נוירון מראש סינפטי איבד את הקשר השריר postsynaptic הסמוך. תהליך ניוונית הוכח להיות פרוגרסיבי לאורך התפתחות הזחל 12 ולא ניתן להסביר על ידי שינוי סינפסה שינוי או נבטים. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 המודעההתצפית של שימוש פגיעה מכנית על מוטציות preexisting היא שזה מאפשר לנתיחה של רצף הזמני של אירועים סלולריים המוביל עד neurodegeneration ב NMJ. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
פגיעה מכנית העצבית שתוארה קודם לכן הפגינו כאן יכול לשמש כדי לגרום לפציעה / מתח העצבים הסגמנטליים של הזחלים תסיסנית . 4 , 5 , 6 , 14 טכניקה זו ניסיוני כבר מועסקים בעבר לנתח את הרצף הזמני של אירועים ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לכל חברי המעבדות קלר ומגי באוניברסיטת קוויניפיאק להצעות מועילות. בפרט, ברצוננו להודות Barron L. לינקולן II לפיתוח assay זה פגיעה בתוך המעבדה קלר. כמו כן, ברצוננו להודות Quinnipiac אוניברסיטת קולג 'לאמנויות ומדע גרנט- In-Aid הוענק ל LC קלר.
Materials
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased/ |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).
- . Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
