Een eenvoudige neurologische mechanische letselmethode om te bestuderen<em> Drosophila</em> Motor Neuron Degeneration
Summary
Hier beschrijven we een eenvoudige en breed toegankelijke methode om segmentale zenuwen in Drosophila larven te beschadigen om neurodegeneratie van motorische neuronen bij de neuromusculaire verbinding (NMJ) van derde instar larven te visualiseren en te kwantificeren.
Abstract
De degeneratie van neuronen komt voor tijdens normale ontwikkeling en in reactie op letsel, stress en ziekte. De cellulaire kenmerken van neuronale degeneratie zijn opmerkelijk vergelijkbaar bij mensen en ongewervelde dieren, evenals de moleculaire mechanismen die deze processen aandrijven. De fruitvlieg, Drosophila melanogaster , biedt een krachtig maar simpel genetisch model organisme om de cellulaire complexiteiten van neurodegeneratieve ziekten te bestuderen. In feite heeft ongeveer 70% van de ziekteverwante menselijke genen een Drosophila homolog en een overvloed aan hulpmiddelen en analyses zijn beschreven met behulp van vliegen om menselijke neurodegeneratieve ziekten te bestuderen. Meer specifiek blijkt dat de neuromusculaire verbinding (NMJ) in Drosophila een effectief systeem is om neuromusculaire ziekten te bestuderen door het vermogen om de structurele verbindingen tussen de neuron en de spier te analyseren. Hier rapporteren we over een in vivo motor neuron letsel test in Drosophila , welkeReproduceerbaar induceert neurodegeneratie bij de NMJ door 24 uur. Met behulp van deze methodologie hebben we een tijdelijke volgorde van cellulaire gebeurtenissen beschreven die resulteren in degeneratie van motorneuronen. De schade-methode heeft diverse toepassingen en is ook gebruikt om specifieke genen die nodig zijn voor neurodegeneratie te identificeren en transcriptie-responsen op neuronale verwonding te dissociëren.
Introduction
Neuronale degeneratie komt voor bij normale ontwikkeling en kan worden veroorzaakt door het natuurlijke verouderingsproces, letsel, stress of ziektetoestanden. Drosophila melanogaster , de gemeenschappelijke vruchtvlieg, biedt een eenvoudig en krachtig modelorganisme om neurodegeneratie te bestuderen door de opmerkelijke overeenkomsten in de moleculaire mechanismen die de degeneratie van neuronen veroorzaken. Deze overeenkomsten worden benadrukt door het feit dat ongeveer 70% van de ziekteverwante menselijke genen een Drosophila homolog hebben. 1 Daarnaast zijn talrijke analyses en technologische instrumenten ontwikkeld voor het bestuderen van menselijke neurodegeneratieve ziekten, ontwikkeld en gebruikt in Drosophila . 2 , 3 Binnen Drosophila staat de neuromusculaire verbinding (NMJ) toe voor analyse van zowel cellulaire als elektrofysiologische eigenschappen en is gebleken dat het een belangrijk systeem is om neuromusculaire ziekte te bestuderen door het zichtbare nEuron-spierverbindingen. 2 In deze studie beschrijven we een in vivo neuron letsel test in Drosophila larven die het reproduceerbare letsel van segmentale zenuwen mogelijk maakt. Dit motoneuron letsel resulteert in een tijdelijke sequentie van cellulaire gebeurtenissen die resulteert in neurodegeneratie bij de NMJ 24 uur na verwonding. Het vermogen om reproductieve bewegingen te veroorzaken die tot neurodegeneratie leiden, hebben diverse toepassingen, zoals het identificeren van specifieke genen die nodig zijn voor het degeneratieve proces, de dissectie van transcriptie-responsen op neuronale verwondingen en de analyse van beschermende signaleringscascades. 4 , 5 , 6 Deze methode is ook gebruikt in combinatie met microfluidica om neuronale degeneratie en regeneratie bij levende dieren te bestuderen. 7
We maken gebruik van een vastgestelde kwantitatieve test om motor neuron degenerat te onderzoekenIon bij de Drosophila NMJ na mechanisch letsel. Deze analyse is gebaseerd op het feit dat het verlies van presynaptisch membraan en eiwitten voorafgaat aan de demontage van het subsynaptische reticulum (SSR), gekenmerkt door de postsynaptische spiermembraanvouwen. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Deze analyse laat de kwantificering van "synaptische voetafdrukken toe" waar de pre-synaptische neuron verbinding heeft verloren met de aangrenzende postsynaptische spier. Het degeneratieve proces blijkt progressief te zijn gedurende de larveontwikkeling 12 en kan niet worden verantwoord door veranderde synapsontwikkeling of spruitvorming. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 De advertentieHet voordeel van het gebruik van mechanisch letsel boven preexisting mutaties is dat het mogelijk maakt dissectie van de tijdelijke volgorde van cellulaire gebeurtenissen die leiden tot neurodegeneratie bij de NMJ. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
Het neuronale mechanische letsel dat eerder is beschreven en hier getoond kan worden gebruikt om schade / stress in de segmentale zenuwen van Drosophila larven te veroorzaken. 4 , 5 , 6 , 14 Deze experimentele techniek is eerder gebruikt om de tijdelijke volgorde van gebeurtenissen die leiden tot neurodegeneratie, te ontleden, evenals transcriptieveranderingen in de motorneurcelcellen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij bedanken alle leden van de Keller en Magie Labs aan de Quinnipiac University voor nuttige suggesties. In het bijzonder willen we Barron L. Lincoln II bedanken voor de ontwikkeling van deze schadebepaling in het Keller Lab. We willen ook de Quinnipiac University College of Arts en Science Grant-In-Aid bedanken aan LC Keller.
Materials
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased/ |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).
- . Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
