Una Metodología Neuronal Simple de Lesiones Mecánicas para Estudiar<em> Drosophila</em> Degeneración de Neuronas Motoras
Summary
Aquí describimos un método simple y ampliamente accesible para lesionar nervios segmentarios en larvas de Drosophila para visualizar y cuantificar la neurodegeneración de neuronas motoras en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de tercer estadio.
Abstract
La degeneración de las neuronas se produce durante el desarrollo normal y en respuesta a lesiones, estrés y enfermedades. Las características celulares de la degeneración neuronal son notablemente similares en los seres humanos e invertebrados como son los mecanismos moleculares que impulsan estos procesos. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster , proporciona un poderoso pero simple organismo modelo genético para estudiar las complejidades celulares de las enfermedades neurodegenerativas. De hecho, aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados a la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila y una plétora de herramientas y ensayos se han descrito utilizando moscas para estudiar enfermedades neurodegenerativas humanas. Más específicamente, la unión neuromuscular (NMJ) en Drosophila ha demostrado ser un sistema eficaz para estudiar enfermedades neuromusculares debido a la capacidad de analizar las conexiones estructurales entre la neurona y el músculo. Aquí, informamos sobre un ensayo de lesión de neurona motora in vivo en Drosophila , queInduce de forma reproducible la neurodegeneración en el NMJ por 24 h. Utilizando esta metodología, hemos descrito una secuencia temporal de eventos celulares que resultan en la degeneración de la neurona motora. El método de lesión tiene diversas aplicaciones y también se ha utilizado para identificar genes específicos necesarios para la neurodegeneración y diseccionar las respuestas transcripcionales a la lesión neuronal.
Introduction
La degeneración neuronal se produce durante el desarrollo normal y puede ser causada por el proceso de envejecimiento natural, lesiones, estrés o estados de enfermedad. Drosophila melanogaster , la mosca común de la fruta, proporciona un organismo modelo simple y poderoso para estudiar la neurodegeneración debido a las notables similitudes en los mecanismos moleculares que impulsan la degeneración de las neuronas. Estas similitudes se destacan por el hecho de que aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados con la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila . 1 Además, numerosos ensayos y herramientas tecnológicas para estudiar enfermedades neurodegenerativas humanas se han desarrollado y utilizado en Drosophila. 2 , 3 Dentro de Drosophila , la unión neuromuscular (NMJ) permite el análisis de las propiedades celulares y electrofisiológicas y ha demostrado ser un importante sistema para estudiar la enfermedad neuromuscular debido a la visible nEurón-músculo. 2 En este estudio, describimos un ensayo de lesión neuronal in vivo en larvas de Drosophila que permite la lesión reproducible de los nervios segmentarios. Esta lesión motoneurónica da lugar a una secuencia temporal de eventos celulares que dan como resultado la neurodegeneración en el NMJ 24 h después de la lesión. La capacidad de motoneuronas de lesión reproducible que da lugar a neurodegeneración tiene aplicaciones diversas tales como la identificación de genes específicos requeridos para el proceso degenerativo, la disección de respuestas transcripcionales a lesión neuronal y el análisis de cascadas de señalización protectora. 4 , 5 , 6 Este método también se ha utilizado en combinación con microfluidos para estudiar la degeneración neuronal y la regeneración en animales vivos. 7
Utilizamos un ensayo cuantitativo establecido para examinar la degeneración de las neuronas motorasIon en el Drosophila NMJ después de lesión mecánica. Este ensayo se basa en el hecho de que la pérdida de membrana y proteínas presinápticas precede al desmontaje del retículo subsináptico (SSR) caracterizado por los pliegues de la membrana muscular postsináptica. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Este ensayo permite la cuantificación de "huellas sinápticas" en las que la neurona pre-sináptica ha perdido la conexión con el músculo postsináptico adyacente. Se ha demostrado que el proceso degenerativo es progresivo a lo largo del desarrollo larvario 12 y no puede explicarse por el desarrollo alterado de la sinapsis o el brote. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 El anuncioLa ventaja de usar lesiones mecánicas sobre mutaciones preexistentes es que permite la disección de la secuencia temporal de eventos celulares que conducen a la neurodegeneración en el NMJ. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
La lesión mecánica neuronal descrita anteriormente y demostrada aquí puede usarse para inducir lesión / estrés en los nervios segmentarios de larvas de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Esta técnica experimental se ha empleado previamente para diseccionar la secuencia temporal de los eventos que conducen a la neurodegeneración, así como para examinar los cambios transcripcionales en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a todos los miembros de los Laboratorios Keller y Magie en la Universidad Quinnipiac por sugerencias útiles. En particular, queremos agradecer a Barron L. Lincoln II por el desarrollo de este ensayo de lesión dentro del Laboratorio Keller. También queremos agradecer a la Universidad de Quinnipiac el premio otorgado a LC Keller.
Materials
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased/ |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).
- . Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
