Uma Metodologia de Lesão Mecânica Neuronal Simples para Estudar<em> Drosophila</em> Degeneração do Neurônio do Motor
Summary
Aqui, descrevemos um método simples e amplamente acessível para ferir nervos segmentares em larvas de Drosophila para visualizar e quantificar neurodegeneração de neurônios motores na junção neuromuscular (NMJ) de larvas de terceiro estádio.
Abstract
A degeneração dos neurônios ocorre durante o desenvolvimento normal e em resposta a lesões, estresse e doença. As características celulares da degeneração neuronal são notavelmente semelhantes em humanos e invertebrados, assim como os mecanismos moleculares que conduzem esses processos. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster , fornece um organismo modelo genético poderoso e simples para estudar as complexidades celulares das doenças neurodegenerativas. Na verdade, aproximadamente 70% dos genes humanos associados à doença possuem um homólogo de Drosophila e uma infinidade de ferramentas e ensaios foram descritos usando moscas para estudar doenças neurodegenerativas humanas. Mais especificamente, a junção neuromuscular (NMJ) em Drosophila provou ser um sistema eficaz para estudar doenças neuromusculares devido à capacidade de analisar as conexões estruturais entre o neurônio e o músculo. Aqui, relatamos um teste de lesão do neurônio motor in vivo em Drosophila , queInduz de forma reprodutiva neurodegeneração no NMJ por 24 h. Usando essa metodologia, descrevemos uma seqüência temporal de eventos celulares resultando em degeneração de neurônio motor. O método de lesão tem diversas aplicações e também foi utilizado para identificar genes específicos necessários para a neurodegeneração e para dissecar as respostas transcricionais à lesão neuronal.
Introduction
A degeneração neuronal ocorre durante o desenvolvimento normal e pode ser causada pelo processo de envelhecimento natural, lesão, estresse ou estados de doença. Drosophila melanogaster , a mosca comum da fruta, fornece um organismo modelo simples e poderoso para estudar a neurodegeneração devido às semelhanças notáveis nos mecanismos moleculares que conduzem à degeneração dos neurônios. Essas semelhanças são destacadas pelo fato de que aproximadamente 70% dos genes humanos associados à doença possuem um homólogo de Drosophila . 1 Além disso, vários ensaios e ferramentas tecnológicas para estudar doenças neurodegenerativas humanas foram desenvolvidos e utilizados em Drosophila . 2 , 3 Dentro da Drosophila , a junção neuromuscular (NMJ) permite a análise de propriedades celulares e eletrofisiológicas e provou ser um sistema importante para estudar doença neuromuscular devido ao visível nConexões euron-músculo. 2 Neste estudo, descrevemos um ensaio de lesão de neurônio in vivo em larvas de Drosophila que permite a lesão reprodutível dos nervos segmentares. Esta lesão do motoneurão resulta em uma seqüência temporal de eventos celulares, resultando em neurodegeneração na lesão NMJ 24 h pós. A capacidade de reproduzir os motoneurônios lesionados resultando em neurodegeneração tem diversas aplicações, como a identificação de genes específicos necessários para o processo degenerativo, a dissecação de respostas transcripcionais à lesão neuronal e a análise de cascatas de sinalização protetora. 4 , 5 , 6 Este método também foi usado em combinação com microfluidics para estudar degeneração neuronal e regeneração em animais vivos. 7
Utilizamos um ensaio quantitativo estabelecido para examinar o degenerato do neurônio motorIon na Drosophila NMJ após lesão mecânica. Este ensaio baseia-se no facto de a perda de membrana pré-sináptica e as proteínas precedem a desmontagem do retículo subsináptico (SSR) caracterizada pelas dobras da membrana do músculo pós-sináptico. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Este ensaio permite a quantificação de "pegadas sinápticas" onde o neurônio pré-sináptico perdeu a conexão com o músculo pós-sináptico adjacente. O processo degenerativo mostrou ser progressivo em todo o desenvolvimento larval 12 e não pode ser explicado pelo desenvolvimento alterado de sinapse ou brotação. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 O anúncioA vantagem de usar lesões mecânicas em mutações preexistentes é que permite a dissecção da seqüência temporal de eventos celulares que conduzem à neurodegeneração no NMJ. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
A lesão mecânica neuronal descrita anteriormente e demonstrada aqui pode ser utilizada para induzir lesão / estresse nos nervos segmentares das larvas de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Esta técnica experimental tem sido empregada anteriormente para dissecar a seqüência temporal de eventos que conduzem à neurodegeneração, bem como para examinar as alterações transcricionais nos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Keller e Magie Labs na Quinnipiac University por sugestões úteis. Em particular, gostaríamos de agradecer Barron L. Lincoln II pelo desenvolvimento deste ensaio de lesões no Keller Lab. Também gostaríamos de agradecer a Quinnipiac University College of Arts and Science Grant-In-Aid concedida à LC Keller.
Materials
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased/ |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
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