A بسيطة العصبية الميكانيكية إصابة منهجية للدراسة<em> ذبابة الفاكهة</em> موتور العصبون التنكس
Summary
نحن هنا وصف طريقة بسيطة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع لإصابة الأعصاب القطعي في يرقات ذبابة الفاكهة لتصور وكمية التنكس العصبي من الخلايا العصبية الحركية في تقاطع عصبي عضلي (نمج) من اليرقات الطور الثالث.
Abstract
يحدث انحطاط الخلايا العصبية أثناء التطور الطبيعي واستجابة للإصابة، والإجهاد، والمرض. السمات الخلوية من انحطاط الخلايا العصبية هي مشابهة بشكل ملحوظ في البشر واللافقاريات كما هي الآليات الجزيئية التي تدفع هذه العمليات. ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ، يوفر قوية ولكنها بسيطة نموذج الكائنات الوراثية لدراسة التعقيدات الخلوية للأمراض الاعصاب. في الواقع، ما يقرب من 70٪ من الجينات البشرية المرتبطة بالمرض لديها هالوجول ذبابة الفاكهة ووصف عدد كبير من الأدوات والمقايسات باستخدام الذباب لدراسة الأمراض العصبية البشرية. على وجه التحديد وقد ثبت تقاطع العصبية والعضلية (نمج) في ذبابة الفاكهة ليكون نظام فعال لدراسة الأمراض العصبية والعضلية بسبب القدرة على تحليل الاتصالات الهيكلية بين الخلايا العصبية والعضلات. هنا، ونحن تقرير عن في الجسم الحي محرك عصبي إصابة الفحص في ذبابة الفاكهة ، والتييستحث بالتكاثر التنكس العصبي في نمج 24 ساعة. باستخدام هذه المنهجية، وصفنا تسلسل الزمني من الأحداث الخلوية مما أدى إلى انحطاط الخلايا العصبية الحركية. طريقة الإصابة لديها تطبيقات متنوعة، كما تم استخدامها لتحديد الجينات المحددة المطلوبة للتنكس العصبي وتشريح الردود النسخي لإصابة الخلايا العصبية.
Introduction
يحدث انحطاط الخلايا العصبية أثناء التطور الطبيعي ويمكن أن يكون سببه عملية الشيخوخة الطبيعية، والإصابة، والإجهاد، أو حالات المرض. ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ، ذبابة الفاكهة المشتركة، يوفر كائن نموذج بسيط وقوي لدراسة التنكس العصبي بسبب تشابه ملحوظ في الآليات الجزيئية التي تدفع انحطاط الخلايا العصبية. يتم تسليط الضوء على أوجه التشابه هذه من خلال حقيقة أن ما يقرب من 70٪ من الجينات البشرية المرتبطة بالمرض لديها هالوجول ذبابة الفاكهة . 1 بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير العديد من المقايسات والأدوات التكنولوجية لدراسة الأمراض العصبية البشرية واستخدامها في ذبابة الفاكهة . 2 ، 3 داخل ذبابة الفاكهة ، وتقاطع عصبي عضلي (نمج) يسمح لتحليل كل من الخصائص الخلوية والكهربية وقد ثبت أن يكون نظاما هاما لدراسة المرض العصبي العضلي بسبب مرئية نوصلات يورون العضلات. 2 في هذه الدراسة، ونحن تصف في الجسم الحي اختبار إصابة الخلايا العصبية في يرقات ذبابة الفاكهة الذي يسمح للإصابة استنساخ من الأعصاب القطاعية. هذه الإصابة موتونورون النتائج في تسلسل زمني من الأحداث الخلوية مما أدى إلى التنكس العصبي في نمج 24 ساعة إصابة آخر. القدرة على إصابة موتورنورونس إصابة استنساخا مما أدى إلى التنكس العصبي لديها تطبيقات متنوعة مثل تحديد الجينات المحددة المطلوبة لعملية التنكسية، وتشريح الردود النسخي لإصابة الخلايا العصبية، وتحليل شلالات الإشارات الوقائية. 4 ، 5 ، 6 وقد استخدمت هذه الطريقة أيضا في تركيبة مع ميكروفليديكش لدراسة انحطاط الخلايا العصبية وتجديد في الحيوانات الحية. 7
نحن نستخدم مقايسة الكمية المحددة لدراسة ديجينيرات الخلايا العصبية الحركيةأيون في نمج بعد ذبابة الفاكهة بعد إصابة ميكانيكية. ويستند هذا الفحص على حقيقة أن فقدان الغشاء قبل المشبكي والبروتينات يسبق تفكيك الشبكية المشبكية (سر) تتميز الطيات غشاء العضلات بعد المشبكي. 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 هذا الفحص يسمح لكمية "أقدام متشابك" حيث فقدت الخلايا العصبية قبل المشبكي اتصال إلى العضلات بعد المشبكي المجاورة. وقد تبين أن العملية التنكسية أن تكون تدريجية في جميع أنحاء تطور اليرقات 12 ولا يمكن أن يحسب عن طريق تغيير المشبك التنمية أو تنتشر. 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 الإعلانالفضل في استخدام إصابات الميكانيكية على الطفرات الموجودة مسبقا هو أنه يسمح لتشريح التسلسل الزمني للأحداث الخلوية المؤدية إلى التنكس العصبي في نمج. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
الإصابات الميكانيكية العصبية وصفها في وقت سابق وأظهرت هنا يمكن استخدامها للحث على الإصابة / الإجهاد في الأعصاب القطعي لليرقات ذبابة الفاكهة . 4 ، 5 ، 6 ، 14 وقد استخدمت هذه التقنية التجريبية ساب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر جميع أعضاء كيلر ومختبرات ماجي في جامعة كوينبياك للحصول على اقتراحات مفيدة. على وجه الخصوص، نود أن نشكر بارون L. لينكولن الثاني لتطوير هذا الفحص الإصابة داخل مختبر كيلر. كما نود أن نشكر كلية كينيبياك كلية الآداب والعلوم منحة في المعونة الممنوحة لك لك كيلر.
Materials
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased/ |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).
- . Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
