研究のための単純な神経細胞学的損傷法<em>ショウジョウバエ</em>運動ニューロン変性
Summary
ここでは、3齢幼虫の神経筋接合部（NMJ）における運動ニューロンの神経変性を視覚化および定量化するために、 ショウジョウバエ幼虫における分節神経を傷つける簡単かつ広くアクセス可能な方法について説明する。
Abstract
ニューロンの変性は、正常な発達中、および傷害、ストレス、および疾患に応答して起こる。ニューロン変性の細胞の特徴は、ヒトおよび無脊椎動物において、これらの過程を駆動する分子メカニズムと同様に著しく類似している。 ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster ）は、神経変性疾患の細胞の複雑さを研究するための強力で単純な遺伝モデル生物を提供する。実際には、疾患関連ヒト遺伝子の約70％がショウジョウバエ相同体を有し、ヒト神経変性疾患を研究するためにハエを用いて多数のツールおよびアッセイが記載されている。より具体的には、 ショウジョウバエの神経筋接合部（NMJ）は、神経細胞と筋肉との間の構造的結合を解析する能力のために、神経筋疾患を研究するための有効なシステムであることが証明されている。ここでは、 ショウジョウバエの in vivo運動ニューロン損傷アッセイについて報告する。24時間までにNMJにおいて神経変性を再現可能に誘発する。この方法論を用いて、運動ニューロン変性をもたらす細胞事象の時間的順序を記載した。傷害方法は多様な用途を有し、神経変性に必要な特定の遺伝子を同定し、神経損傷に対する転写応答を解剖するために利用されている。
Introduction
ニューロンの変性は、正常な発達中に起こり、自然な老化過程、傷害、ストレス、または病状によって引き起こされうる。 ショウジョウバエのmelanogasterは、一般的なフルーツフライは、ニューロンの変性を駆動する分子メカニズムの顕著な類似性のため、神経変性を研究するためのシンプルで強力なモデル生物を提供します。これらの類似性は、疾患関連ヒト遺伝子の約70％がショウジョウバエ相同体を有するという事実によって強調される。 1はまた、数多くのアッセイおよび人間の神経変性疾患を研究するための技術のツールは、ショウジョウバエで開発され、利用されています。 ショウジョウバエ内で2、3、神経筋接合部（NMJ）は、両方の細胞および電気生理学的特性の解析を可能にし、可視nに神経筋疾患を研究するための重要なシステムであることが証明されましたユーロン – 筋肉の接続。 図2は、本研究では、分節神経の再現性の傷害を可能にし、ショウジョウバエの幼虫におけるin vivo神経細胞傷害アッセイを説明します。この運動ニューロン損傷は、損傷後24時間のNMJにおいて神経変性を生じる細胞事象の一時的な配列を生じる。神経変性を生じる運動ニューロンを再現可能に傷つける能力は、変性過程に必要とされる特定の遺伝子の同定、ニューロン損傷に対する転写応答の解剖および保護シグナル伝達カスケードの分析などの多様な用途を有する。 図4、 図5、 図6は、この方法は、生きている動物における神経変性および再生を研究するために、マイクロ流体と組み合わせて使用されてきました。 7
我々は、確立された定量アッセイを利用して、運動ニューロン変性イオンが機械的損傷後にショウジョウバエ NMJで検出される。このアッセイは、シナプス前膜およびタンパク質の損失が、シナプス後の筋膜の折畳みによって特徴付けられる潜在網状赤血球（SSR）の分解に先行するという事実に基づいている。 8、9、10、11、12、13このアッセイは、シナプス前ニューロンが隣接シナプス後筋肉への接続を失った「シナプス足跡」の定量化を可能にします。変性工程は、幼虫の発育12を通じて進行性であることが示されており、変更されたシナプスの発達又は発芽によって説明することができません。 8、9、10、11、12広告既存の突然変異よりも機械的損傷を使用することの利点は、それが、NMJでの神経変性に至る細胞事象の時間的順序の解剖を可能にすることである。 13
Protocol
Representative Results
Discussion
以前に記載され、ここに示されたニューロンの機械的損傷は、 ショウジョウバエの幼虫の分節神経における損傷/ストレスを誘発するために使用され得る。 4、5、6、14この実験的手法は、神経変性を導く事象の時系列を分析するために、ならびに損傷後の運動ニューロンの細胞体における?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちはQuinnipiac UniversityのKellerとMagie Labsのメンバー全員に有益な提案をいただき、ありがとうございます。特に、Keller Lab内でこの損傷アッセイを開発したBarron L. Lincoln IIに感謝したいと思います。 LC Kellerに授与されたQuinnipiac University of Arts and Science Grant-In-Aidにも感謝したいと思います。
Materials
| Micro-dissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Some people prefer size 3, while others prefer size 5 |
| CO2 Air Tank | Tech Air | UN 1013 | Various tank sizes can be purchased/ |
| CO2 Anesthetizing Apparatus | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Stainless-steel pins, size 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent | Dow Corning | 3097358-1004 | To pour dissecting plates |
| Bouin's Solution | Sigma | HT 10132-1L | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Affymetrix | FLY-8030-20 | Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin's and PFA |
| Dissecting Stereo MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| Light Source | AmScope | HL150-AY-220V | |
| anti- nc82 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82-s | |
| anti-discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | One can you Alexa Fluor® 488, 594 or 647 |
| Flystuff Grape Juice Agar Premix | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Microscope slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Used to create humid chamber for larval recovery |
References
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).
- . Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
