Quantification de la densité de branchement dans les boîtes entières de glandes mammaires de rat utilisant la méthode d'analyse Sholl
Summary
Le développement des glandes mammaires chez le rongeur a généralement été évalué à l'aide d'évaluations descriptives ou en mesurant les attributs physiques de base. La densité de branchement est un indicateur du développement mammaire difficile à quantifier objectivement. Ce protocole décrit une méthode fiable pour l'évaluation quantitative des caractéristiques de ramification des glande mammaire.
Abstract
Un nombre croissant d'études utilisent la glande mammaire de rongeur comme point final pour évaluer la toxicité pour le développement d'une exposition chimique. Les effets de ces expositions sur le développement des glandes mammaires sont généralement évalués en utilisant des mesures dimensionnelles de base ou en décrivant des caractéristiques morphologiques. Cependant, le large éventail de méthodes pour interpréter les changements de développement pourrait conduire à des traductions incompatibles entre les laboratoires. Une méthode d'évaluation commune est nécessaire pour que les interprétations appropriées puissent être formées à partir de données comparées entre les études. La présente étude décrit l'application de la méthode d'analyse Sholl pour quantifier les caractéristiques de ramification des glandes mammaires. La méthode Sholl a été développée à l'origine pour être utilisée dans la quantification des modèles dendritiques neuronaux. En utilisant ImageJ, un progiciel d'analyse d'image open source et un plugin développés pour cette analyse, la densité de ramification de la glande mammaire et la complexité de l'amLa glande ammaire d'un rat femelle peripubertaire a été déterminée. Les méthodes décrites ici permettront l'utilisation de l'analyse Sholl comme outil efficace pour quantifier une caractéristique importante du développement de la glande mammaire.
Introduction
La branchement de la glande mammaire est une caractéristique qui est généralement évaluée comme un indicateur du développement des glandes, mais il est difficile de quantifier objectivement. En 1953, Sholl 1 décrit une méthode pour mesurer l'arborisation dendritique neuronale dans les cortices visuels et moteurs du chat, et un plugin pour cette technique a été développé par Ferriera et al 2 . Parce que les neurones et les glandes mammaires présentent une structure semblable à celle d'un arbre similaire, le plugin a été utilisé pour quantifier les densités de ramifications épithéliales mammaires dans les images 2D de la glande mammaire du rat peripubertal. Le stade peripubertal a été choisi pour analyse car le sevrage est une étape de la vie qui est souvent évaluée dans les laboratoires universitaires et les études de référence. L'analyse Sholl est un plugin distribué avec FIJI, qui est le pack de traitement d'image open source ImageJ, avec des plugins supplémentaires inclus. Le plugin crée une série d'anneaux concentriques encerclant un Predef(Généralement le soma d'un neurone ou l'origine du conduit primaire d'une glande mammaire) et s'étend jusqu'à la partie la plus distale de l'objet (le rayon d'enceinte). Il compte alors le nombre d'intersections (N) qui se produisent sur chacun des anneaux. Le plugin renvoie également un coefficient de régression Sholl ( k ), qui est une mesure du taux de désintégration de la ramification épithéliale.
À l'aide d'ImageJ, une image squelettisée d'un ensemble de glandes mammaires est créée et la zone épithéliale mammaire (MEA) est mesurée. L'image est analysée à l'aide du plugin d'analyse Sholl, et les valeurs pour N et k , entre autres valeurs non utilisées ici, sont renvoyées. La densité de ramification épithéliale mammaire est déterminée en calculant N / MEA. La mesure dans laquelle la ramification se poursuit dans les régions extérieures de l'épithélium glandulaire est la complexité de la ramification et est un indicateur d'une croissance épithéliale distale uniforme. Comme k est une mesure de la diminution distale de l'épithElial Branching, c'est une mesure efficace de la complexité de la ramification et un indicateur fiable du développement mammaire.
Ce protocole décrit une méthode assistée par ordinateur pour créer des images squelettisées de montures entières de glandes mammaires et évaluer quantitativement les caractéristiques de ramification mammaire chez des rats mâles et femelles peripubertaux. Cette méthode est relativement rapide et ne requiert pas l'utilisation d'équipements microscopiques spécialisés. Le développement et la validation de cette méthode sont décrits dans Stanko et al. (2015) 3 . Ce rapport décrit également la préparation de la glande mammaire de rat entière = des supports. Des procédures de montage total mammaire semblables ont été décrites dans Assis et al. (2010) 4 et Plante et al. (2011) 5 .
Protocol
Representative Results
Discussion
De la naissance à la puberté, la croissance de la glande mammaire est allométrique. Après la puberté, la glande mammaire se développe grâce à une ramification et un allongement ductal étendus, qui se poursuivent jusqu'à ce que l'épithélium mammaire occupe l'intégralité de la graisse. Les caractéristiques de branchement sont un aspect important du développement de la glande mammaire et la capacité de quantifier objectivement ces caractéristiques peut être très utile pour évaluer le dével…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier le Dr Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) pour son aide à la validation de cette méthode et le Dr Tiago Ferreira (Université McGill, Montréal, Québec, Canada) pour son continu Aide à l'application Sholl.
Materials
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
References
- Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
- Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
- Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012)
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
- Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
- Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
- Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
- Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
- Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
- Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).
