كوانتينغينغ المتفرعة الكثافة في الجرذ الغدة الثديية كله يتصاعد باستخدام طريقة تحليل شول
Summary
وقد تم تقييم تنمية الغدد الثديية في القوارض عادة باستخدام التقييمات الوصفية أو من خلال قياس الخصائص الفيزيائية الأساسية. الكثافة المتفرعة هي مؤشر على تطور الثديية التي يصعب قياسها بشكل موضوعي. يصف هذا البروتوكول طريقة موثوق بها لتقييم الكمي من الخصائص المتفرعة الغدة الثديية.
Abstract
وهناك عدد متزايد من الدراسات التي تستخدم الغدة الثديية القوارض كنقطة نهاية لتقييم السمية التنموية للتعرض الكيميائية. يتم تقييم آثار هذه التعرضات على التنمية الغدة الثديية عادة باستخدام إما القياسات الأبعاد الأساسية أو عن طريق تسجيل الخصائص المورفولوجية. ومع ذلك، فإن مجموعة واسعة من الطرق لتفسير التغيرات التنموية يمكن أن يؤدي إلى ترجمة غير متناسقة عبر المختبرات. وهناك حاجة إلى طريقة مشتركة للتقييم بحيث يمكن تشكيل تفسيرات سليمة من البيانات التي تتم مقارنتها عبر الدراسات. وتصف هذه الدراسة تطبيق طريقة تحليل شول لتحديد خصائص الغدة الثديية المتفرعة. تم تطوير طريقة شول أصلا لاستخدامها في قياس أنماط العصبية شجيري. باستخدام إيماجيج، صورة مفتوحة المصدر تحليل البرمجيات حزمة، والمكونة وضعت لهذا التحليل، والغدة الثديية المتفرعة الكثافة وتعقيد آمتم تحديد الغدة الثديية من الفئران الإناث بيريبوبيرتال. سوف الطرق المذكورة هنا تمكين استخدام تحليل شول كأداة فعالة لقياس سمة هامة للتنمية الغدة الثديية.
Introduction
الغدة الثديية المتفرعة هي السمة التي يتم تقييمها عادة كمؤشر على تنمية الغدة، ولكن من الصعب تحديد موضوعي. في عام 1953، وصف شول 1 طريقة لقياس أربوريزاتيون شجيري العصبية في القشور البصرية والحركية للقط، وقد تم تطوير البرنامج المساعد لهذه التقنية من قبل فيريرا وآخرون 2 . لأن كلا من الخلايا العصبية والغدد الثديية تظهر بنية تشبه شجرة مماثلة، تم استخدام البرنامج المساعد لتحديد كثافة الثديية المتفرعة الظهارية في الصور 2D من الغدة الثديية الجرذ بيريبوبيرتال. تم اختيار المرحلة المحيطة بالحيوية للتحليل لأن الفطام هو مرحلة حياة يتم تقييمها غالبا في المختبرات الأكاديمية ودراسات توجيه الاختبار. تحليل شول هو البرنامج المساعد توزيعها مع فيجي، وهو مفتوح المصدر حزمة معالجة الصور إيماجيج، مع الإضافات الإضافية المدرجة. البرنامج المساعد يخلق سلسلة من حلقات متحدة المركز تطويق بريديف(عادة سوما من الخلايا العصبية أو أصل القناة الرئيسية للغدة الثديية) وتمتد إلى الجزء البعيد البعيدة من الكائن (دائرة نصف قطرها مرفق). ثم تحسب عدد التقاطعات (N) التي تحدث على كل من الحلقات. ويعود البرنامج المساعد أيضا معامل الانحدار شول ( ك )، وهو قياس معدل تسوس من المتفرعة الظهارية.
باستخدام إيماجيج، يتم إنشاء صورة سكيليونيزد من الغدة الثديية كله جبل ويتم قياس المنطقة الظهارية الثديية (ميي). يتم تحليل الصورة باستخدام البرنامج المساعد تحليل شول، والقيم ل N و k ، من بين القيم الأخرى غير المستخدمة هنا، يتم إرجاعها. يتم تحديد الثديية الظهارة المتفرعة الظهارية من خلال حساب N / ميي. مدى استمرار المتفرعة في المناطق الخارجية من ظهارة غدية هو التعقيد المتفرعة وهو مؤشر على النمو الظهاري البعيدة موحدة. كما ك هو مقياس للانخفاض البعيدة في إبيثإليان المتفرعة، بل هو مقياس فعال للتعقيد المتفرعة ومؤشر موثوقة للتنمية الثديية.
يصف هذا البروتوكول طريقة بمساعدة الكمبيوتر لخلق صور الهيكل العظمي من الغدة الثديية يتصاعد كله وتقييم كميا الخصائص المتفرعة الثديية في الذكور بيريبوبيرتال والفئران الإناث. هذه الطريقة سريعة نسبيا ولا تتطلب استخدام معدات المجهر المتخصصة. يتم وصف التطوير والتحقق من هذه الطريقة في ستانكو وآخرون. (2015) 3 . ويصف هذا التقرير أيضا إعداد الفئران الثديية الغدة كله = يتصاعد. وقد وصفت إجراءات مماثلة جبل كامل الثدي في دي أسيس وآخرون. (2010) 4 و بلانتي وآخرون. (2011) 5 .
Protocol
Representative Results
Discussion
من الولادة حتى سن البلوغ، نمو الغدة الثديية هو قياس ألوميتريك. بعد سن البلوغ، الغدة الثديية تتطور من خلال واسعة المتفرعة الأقنية واستطالة، والتي تستمر حتى تحت ظهارة الثديية يحتل كامل لوحة الدهون. الخصائص المتفرعة هي جانب مهم من التنمية الغدة الثديية، والقدرة على تح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدكتور مايكل إيسترلينغ (النظم الاجتماعية والعلمية، دورهام، نك) لمساعدته في التحقق من صحة هذه الطريقة والدكتور تياغو فيريرا (جامعة ماكغيل، مونتريال، كيبيك، كندا) المساعدة مع تطبيق شول.
Materials
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
References
- Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
- Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
- Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012)
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
- Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
- Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
- Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
- Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
- Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
- Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).
