Quantificazione della densità di raggruppamento nelle ghiandole del mammella di ratto intere con il metodo di analisi di Sholl
Summary
Lo sviluppo della ghiandola mammaria nel roditore è stato tipicamente valutato utilizzando valutazioni descrittive o misurando gli attributi fisici di base. La densità di derivazione è un indicatore dello sviluppo mammario che è difficile da quantificare in modo oggettivo. Questo protocollo descrive un metodo affidabile per la valutazione quantitativa delle caratteristiche di ramificazione delle ghiandole mammarie.
Abstract
Un numero crescente di studi stanno utilizzando la ghiandola mammaria di roditore come un endpoint per valutare la tossicità dello sviluppo di un'esposizione chimica. Gli effetti che queste esposizioni hanno sullo sviluppo delle ghiandole mammarie sono tipicamente valutate utilizzando misure di dimensione basale o rilevando caratteristiche morfologiche. Tuttavia, l'ampia gamma di metodi per interpretare i cambiamenti nello sviluppo può portare a traduzioni incoerenti tra i laboratori. È necessario un metodo comune di valutazione in modo che possano essere formate delle correttive interpretazioni dai dati che vengono confrontati negli studi. Il presente studio descrive l'applicazione del metodo di analisi di Sholl per quantificare le caratteristiche di ramificazione delle ghiandole mammarie. Il metodo Sholl è stato originariamente sviluppato per l'uso nella quantificazione dei modelli neuronali dendritici. Utilizzando ImageJ, un pacchetto software di analisi di immagini open source e un plugin sviluppato per questa analisi, la densità di ramificazione della ghiandola mammaria e la complessità diLa ghiandola ammia da un ratto femminile peripubertale è stata determinata. I metodi qui descritti consentiranno l'utilizzo dell'analisi di Sholl come uno strumento efficace per quantificare una caratteristica importante dello sviluppo della ghiandola mammaria.
Introduction
La ramificazione delle ghiandole mammarie è una caratteristica che comunemente viene valutata come indicatore dello sviluppo delle ghiandole, ma è difficile quantificare oggettivamente. Nel 1953, Sholl 1 descritto un metodo per misurare neuronale arborization dendritiche nella corteccia motorie e visive del gatto, e un plugin per questa tecnica è stata sviluppata da Ferriera et al 2. Poiché entrambi i neuroni e le ghiandole mammarie presentano una struttura simile ad albero, il plugin è stato impiegato per quantificare la densità di ramificazione epiteliale mammaria in immagini 2D della ghiandola mammaria del ratto peripubertale. Lo stadio peripubertale è stato scelto per l'analisi perché lo svezzamento è una fase di vita spesso valutata nei laboratori accademici e negli studi di orientamento test. L'analisi di Sholl è un plugin distribuito con FIJI, il pacchetto ImageJ di elaborazione delle immagini open source, con plugin aggiuntivi inclusi. Il plugin crea una serie di anelli concentrici che circondano un predef(In genere il soma di un neurone o l'origine del condotto primario di una ghiandola mammaria) e che si estende fino alla parte più distale dell'oggetto (il raggio di chiusura). Quindi conta il numero di intersezioni (N) che si verificano su ciascuno degli anelli. Il plugin restituisce anche un coefficiente di regressione Sholl ( k ), che è una misura della velocità di decadimento della ramificazione epiteliale.
Usando ImageJ, viene creata un'immagine scheletrata di una ghiandola mammaria completa e viene misurata l'area epiteliale mammaria (MEA). L'immagine viene analizzata usando il plugin di analisi di Sholl e vengono restituiti i valori per N e k , tra gli altri valori non utilizzati qui. La densità di ramificazione dell'epitelio mammario è determinata calcolando N / MEA. La misura in cui la ramificazione continua nelle regioni esterne dell'epitelio ghiandolare è la complessità di ramificazione e rappresenta un indicatore di crescita uniforme epiteliale distale. Come k è una misura della diminuzione distale dell'epitRamificazione elitaria, è una misura efficace della complessità di ramificazione e un indicatore affidabile dello sviluppo mammario.
Questo protocollo descrive un metodo informatico assistito per la creazione di immagini scheletriche di ghiandole mammarie e di valutare quantitativamente le caratteristiche di ramificazione del mammario nei ratti maschi e femmine peripubertali. Questo metodo è relativamente rapido e non richiede l'uso di apparecchiature microscopiche specializzate. Lo sviluppo e la convalida di questo metodo sono descritti in Stanko et al. (2015) 3 . Questo rapporto descrive anche la preparazione di ghiandole mammarie di ratto whole = montanti. Sono state descritte procedure similari di mammary intere montagne in Assis et al. (2010) 4 e Plante et al. (2011) 5 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Dalla nascita fino alla pubertà, la crescita delle ghiandole mammarie è allometrico. Dopo la pubertà, la ghiandola mammaria si sviluppa attraverso un'estesa ramificazione e allungamento dei dotti, che continuano fino a quando l'epitelio mammario occupa l'intero grasso di grasso. Le caratteristiche di ramificazione sono un aspetto importante dello sviluppo della ghiandola mammaria e la capacità di quantificare oggettivamente queste caratteristiche può essere estremamente utile per valutare lo sviluppo no…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere il dottor Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) per la sua assistenza con la convalida di questo metodo e il dottor Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canada) per la sua continua Assistenza con l'applicazione Sholl.
Materials
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
References
- Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
- Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
- Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012)
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
- Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
- Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
- Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
- Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
- Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
- Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).
