Количественная оценка плотности ветвлений в клетках грудной железы крысы с полным ходом с использованием метода анализа Sholl
Summary
Развитие молочной железы у грызунов обычно оценивалось с использованием описательных оценок или путем измерения основных физических характеристик. Плотность ветвления является показателем развития молочной железы, который трудно объективно оценить количественно. Этот протокол описывает надежный метод количественной оценки характеристик ветвления молочной железы.
Abstract
Все большее число исследований использует молочную железу грызунов в качестве конечной точки для оценки токсичности развития химического воздействия. Эффекты, которые эти воздействия оказывают на развитие молочной железы, обычно оцениваются с использованием либо основных измерений размеров, либо путем оценки морфологических характеристик. Однако широкий спектр методов интерпретации изменений в области развития может привести к несовместимым переводам в лабораториях. Необходим общий метод оценки, чтобы можно было интерпретировать правильные интерпретации из сопоставимых данных по исследованиям. В настоящем исследовании описывается применение метода анализа Шолла для количественной оценки характеристик ветвления молочной железы. Метод Sholl был первоначально разработан для использования при количественном определении нейронных дендритных структур. Используя ImageJ, пакет программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом и плагин, разработанный для этого анализа, плотность разветвления молочной железы и сложность amОпределяли аммиачную железу от перипубертальной женской крысы. Описанные здесь методы позволят использовать анализ Sholl как эффективный инструмент для количественной оценки важной характеристики развития молочной железы.
Introduction
Разветвление молочной железы является характеристикой, которая обычно оценивается как индикатор развития железы, но ее объективно объективно оценить невозможно. В 1953 году Шолл 1 описал метод измерения нейронной дендритной арборизации в зрительной и моторной коре кошки, а плагин для этой техники был разработан Ферриере и др. 2 . Поскольку и нейроны, и молочные железы имеют сходную древовидную структуру, плагин использовался для количественного определения плотности размножения эпителиальных млекопитающих в двумерных изображениях молочной железы перибубертальной крысы. Перипубертальный этап был выбран для анализа, потому что отлучение – это жизненный этап, который часто оценивается в академических лабораториях и исследованиях по тестированию. Анализ Sholl представляет собой плагин, распространяемый с помощью FIJI, который представляет собой пакет обработки изображений ImageJ с открытым исходным кодом, включая дополнительные плагины. Плагин создает ряд концентрических колец, окружающих predef(Как правило, сома нейрона или происхождение первичного канала молочной железы) и простирается до самой дистальной части объекта (радиус окружения). Затем он подсчитывает количество пересечений (N), которые встречаются на каждом из колец. Плагин также возвращает коэффициент регрессии Sholl ( k ), который является измерением скорости распада эпителиального ветвления.
Используя ImageJ, создается скелетонизированное изображение цельной смолы молочной железы и измеряется площадь эпителия молочной железы (MEA). Изображение анализируется с использованием плагина анализа Sholl, а значения для N и k , среди других значений, не используемых здесь, возвращаются. Плотность разветвления эпителия молочной железы определяется путем расчета N / MEA. Степень, в которой ветвление продолжается во внешних областях железистого эпителия, является сложностью ветвления и является показателем равномерного роста дистального эпителия. Поскольку k является мерой дистального уменьшения в эпитетеВетвь элиты, это эффективная мера сложности ветвления и надежный показатель развития молочной железы.
В этом протоколе описывается компьютерный метод для создания скелетонизированных изображений цельных гормонов молочной железы и количественной оценки характеристик ветвления молочной железы у перипубертальных самцов и самцов крыс. Этот метод является относительно быстрым и не требует использования специализированного оборудования для микроскопии. Разработка и валидация этого метода описаны в Stanko et al. (2015 год) 3 . В этом отчете также описывается подготовка крысиной молочной железы all = mounts. Подобные процедуры полного восстанавления молочной железы описаны в работе Assis et al. (2010) 4 и Plante et al. (2011 год) 5 .
Protocol
Representative Results
Discussion
От рождения до полового созревания рост молочной железы является аллометричным. После полового созревания молочная железа развивается в результате обширного ветвления и удлинения протоков, которые продолжаются до тех пор, пока эпителий молочной железы не займет всю жировую подушку. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Михаэля Истринга (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) за его помощь в проверке этого метода и доктора Тьяго Феррейры (Университет Макгилла, Монреаль, Квебек, Канада) за его постоянную Помощь с помощью приложения Sholl.
Materials
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
References
- Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
- Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
- Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012)
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
- Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
- Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
- Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
- Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
- Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
- Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).
