Summary

Quantifizierung der Verzweigungsdichte in Ratten-Mamma-Gland-Vollkonserven unter Verwendung der Sholl-Analysemethode

Published: July 12, 2017
doi:

Summary

Die Brustdrüsenentwicklung im Nagetier wurde typischerweise mit deskriptiven Beurteilungen oder durch Messung von physikalischen Grundattributen ausgewertet. Die Verzweigungsdichte ist ein Indikator für die Entwicklung von Mamma, der objektiv schwer zu quantifizieren ist. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode für die quantitative Beurteilung der Mamma-Drüsen-Verzweigungseigenschaften.

Abstract

Eine zunehmende Anzahl von Studien nutzt die Nagetier-Brustdrüse als Endpunkt für die Beurteilung der Entwicklungstoxizität einer chemischen Exposition. Die Effekte, die diese Expositionen auf die Entwicklung von Brustdrüsen haben, werden typischerweise unter Verwendung von entweder grundlegenden Dimensionsmessungen oder durch Auswertung von morphologischen Merkmalen ausgewertet. Die breite Palette von Methoden zur Interpretation von Entwicklungsänderungen könnte jedoch zu inkonsistenten Übersetzungen in Laboratorien führen. Eine gängige Bewertungsmethode ist erforderlich, damit aus den Daten, die über Studien hinweg verglichen werden, richtige Interpretationen entstehen können. Die vorliegende Studie beschreibt die Anwendung der Sholl-Analyse-Methode zur Quantifizierung der Mamma-Drüsen-Verzweigungseigenschaften. Die Sholl-Methode wurde ursprünglich für die Verwendung bei der Quantifizierung von neuronalen dendritischen Mustern entwickelt. Durch die Verwendung von ImageJ, einem Open-Source-Bildanalyse-Softwarepaket und einem für diese Analyse entwickelten Plugin, der Verzweigungsdichte der Brustdrüse und der Komplexität von amAmmary Drüse aus einer peripubertären weiblichen Ratte wurden bestimmt. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die Verwendung der Sholl-Analyse als wirksames Instrument zur Quantifizierung eines wichtigen Merkmals der Brustdrüsenentwicklung.

Introduction

Die Brustdrüsenverzweigung ist ein charakteristisches Merkmal, das allgemein als Indikator der Drüsenentwicklung beurteilt wird, aber es ist schwer objektiv zu quantifizieren. Im Jahr 1953 beschrieb Sholl 1 eine Methode zur Messung der neuronalen dendritischen Arborisierung in den visuellen und motorischen Kortizes der Katze, und ein Plugin für diese Technik wurde von Ferriera et al 2 entwickelt . Da sowohl Neuronen als auch Brustdrüsen eine ähnliche baumartige Struktur aufweisen, wurde das Plugin zur Quantifizierung von Mamma-Epithel-Verzweigungsdichten in 2D-Bildern der peripubertären Ratten-Brustdrüse verwendet. Die peripubertäre Bühne wurde für die Analyse ausgewählt, weil die Entwöhnung eine Lebensphase ist, die oft in akademischen Laboratorien und Testrichtlinien untersucht wird. Die Sholl-Analyse ist ein Plugin, das mit FIJI verteilt wird, welches das Open-Source-Bildverarbeitungspaket ImageJ ist, mit zusätzlichen Plugins. Das Plugin schafft eine Reihe von konzentrischen Ringen, die ein Predef umkreisen(Typischerweise das Soma eines Neurons oder der Ursprung des Primärkanals einer Milchdrüse) und erstreckt sich bis zum distalsten Teil des Objekts (der umschließende Radius). Es zählt dann die Anzahl der Kreuzungen (N), die auf jedem der Ringe auftreten. Das Plugin gibt auch einen Sholl-Regressionskoeffizienten ( k ) zurück, der eine Messung der Rate des Zerfalls der Epithelverzweigung ist.

Mit ImageJ wird ein skelettiertes Bild einer Brustdrüsen-Ganzmasse erstellt und der Mamma-Epithelbereich (MEA) gemessen. Das Bild wird mit dem Sholl-Analyse-Plugin analysiert und Werte für N und k , unter anderen hier nicht genutzten Werten, werden zurückgegeben. Die Mamma-Epithel-Verzweigungsdichte wird durch Berechnung von N / MEA bestimmt. Das Ausmaß, in dem die Verzweigung in den äußeren Regionen des Drüsenepithels fortdauert, ist die Verzweigungskomplexität und ist ein Indikator für ein gleichmäßiges distales Epithelwachstum. Da k ein Maß für die distale Abnahme des Epiths istEliale Verzweigung, ist es ein wirksames Maß für die Verzweigungskomplexität und ein zuverlässiger Indikator für die Entwicklung von Mamma.

Dieses Protokoll beschreibt eine computergestützte Methode zur Erzeugung von skelettierten Bildern von Brustdrüsen-Vollkästen und quantitativen Auswerten von Mamma-Verzweigungseigenschaften bei peripubertalen männlichen und weiblichen Ratten. Diese Methode ist relativ schnell und erfordert nicht die Verwendung von spezialisierten Mikroskopie Ausrüstung. Entwicklung und Validierung dieser Methode sind in Stanko et al. (2015) 3 Dieser Bericht beschreibt auch die Vorbereitung der Ratten-Brustdrüsen-Ganzheit. Ähnliche Mamma-Vollmontageverfahren wurden in de Assis et al. Beschrieben . (2010) 4 und Plante et al. (2011) 5 .

Protocol

Alle Tiernutzungen und -verfahren für diese Studie wurden vom NIEHS Laboratory Animal Care and Use Committee genehmigt und in einer Assoziation zur Bewertung und Akkreditierung von Laboratoriums-Tierpflege-akkreditierten Einrichtungen durchgeführt. 1. Getreide Mamma Drüsen Vor-Etikett alle Folien mit einer Xylol-Beweis-Methode (Bleistift funktioniert am besten). Decken Sie sie mit Montage-Lösung am Ende, um das Etikett zu bewahren. Euthanisieren Sie das Tier durch ei…

Representative Results

Die in diesem Protokoll analysierten Werte für den gemessenen eingeschlossenen Radius, MEA, N, k und die berechnete Verzweigungsdichte für die Brustdrüse sind in Tabelle 1 angegeben . Die Sholl-Analyse erzeugt lineare und halb-log-Plots der Anzahl der Kreuzungen bei jedem Radius ( Abbildung 9 ) und, falls ausgewählt, eine Wärmekarte der Kreuzungen ( Abbildung 10 ). Weniger entwickelte Drüsen weise…

Discussion

Von der Geburt bis zur Pubertät ist das Brustdrüsenwachstum allometrisch. Nach der Pubertät entwickelt sich die Brustdrüse durch umfangreiche duktale Verzweigung und Dehnung, die sich fortsetzen, bis das Mammaepithel das gesamte Fettkissen einnimmt. Verzweigungscharakteristiken sind ein wichtiger Aspekt der Entwicklung von Brustdrüsen, und die Fähigkeit, diese Eigenschaften objektiv zu quantifizieren, kann sehr nützlich sein, um die normale Entwicklung der Mamma zu beurteilen und eine abnormale Entwicklung nach f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) für seine Unterstützung bei der Validierung dieser Methode und Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Kanada) für seine kontinuierliche ansprechen Unterstützung bei der Sholl-Anmeldung.

Materials

Dissecting board NA NA A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins Daigger EF7419A
Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors Fine Science Tools 14569-09
Straight dissecing scissors Fine Science Tools 14568-09
Curved forceps Fine Science Tools 11003-12
Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001 Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm Fisher scientific 12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher scientific 13-374-12
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)  Sigma-Aldrich 24102
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Carmine alum  Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate  Sigma-Aldrich A6435
Permount mounting media Fisher Scientific SP15
Macroscope Leica Z16 APO  This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera Leica DFC295
Camera software Leica Leica Application Suite v3.1 
ImageJ software Open source http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis  Open source http://imagej.net/Sholl_Analysis

References

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
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Cite This Article
Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).

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