Kwantificerende vertakkingsdichtheid in Rat Mammary Gland Whole-mounts Met behulp van de Sholl Analyse Methode
Summary
Ontwikkeling van de mammageklier in het knaagdier is typisch geëvalueerd met behulp van beschrijvende beoordelingen of door het meten van basis fysieke attributen. Vertakingsdichtheid is een indicator van de ontwikkeling van de moeders die moeilijk is om objectief te kwantificeren. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de kwantitatieve beoordeling van de vertakkingseigenschappen van de borstklier.
Abstract
Een toenemend aantal studies maakt gebruik van de knaagdier-klier als een eindpunt voor de beoordeling van de ontwikkelingstoxiciteit van een chemische blootstelling. De effecten die deze blootstellingen hebben op de ontwikkeling van de borstklier worden typisch geëvalueerd met behulp van basisdimensionale metingen of door morfologische kenmerken te scoren. Het brede scala van methoden voor het interpreteren van ontwikkelingsveranderingen kan echter leiden tot inconsistente vertalingen in laboratoria. Een gemeenschappelijke beoordelingsmethode is nodig, zodat er goede interpretaties kunnen worden gevormd uit gegevens die in vergelijking met studies worden vergeleken. De onderhavige studie beschrijft de toepassing van de Sholl analysemethode om de vertakkingseigenschappen van de borstklier te kwantificeren. De Sholl-methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik bij het kwantificeren van neuronale dendritische patronen. Door gebruik te maken van ImageJ, is een softwarepakket voor open-source beeldanalyse en een plugin ontwikkeld voor deze analyse, de vertakkingsdichtheid van de borstkanker en de complexiteit van amAmmerklier van een peripubertal vrouwelijke rat werden bepaald. De hier beschreven methoden maken het gebruik van de Sholl-analyse mogelijk als een effectief hulpmiddel om een belangrijk kenmerk van de ontwikkeling van de borstklier te kwantificeren.
Introduction
Mammary gland branching is een kenmerk dat algemeen wordt beschouwd als een indicator van de ontwikkeling van de klier, maar het is moeilijk om objectief te kwantificeren. In 1953 beschreef Sholl 1 een methode voor het meten van neuronale dendritische arborisatie in de visuele en motorische cortices van de kat en een plugin voor deze techniek werd ontwikkeld door Ferriera et al. 2 . Omdat beide neuronen en mammeklieren een soortgelijke boomachtige structuur vertonen, werd de plugin gebruikt om de epitheliale vertakkingsdichtheden van de mammografische epitheel te kwantificeren in 2D beelden van de peripubertal-ratmembraan. De peripubertalfase werd gekozen voor analyse omdat het spenen is een levensfase die vaak wordt beoordeeld in academische laboratoria en testrichtlijnen. De Sholl analyse is een plugin verdeeld met FIJI, dat is het open source image processing pakket ImageJ, met extra plugins opgenomen. De plugin creëert een reeks concentrische ringen die een predef omringenIn het centrum (typisch de soma van een neuron of de oorsprong van het primaire kanaal van een borstkanker) en strekt zich uit naar het meest distale deel van het voorwerp (de omhullende radius). Het telt dan het aantal kruispunten (N) dat op elk van de ringen voorkomt. De plugin geeft ook een Sholl regressiecoëfficiënt ( k ), die een afmeting van de verval van epitheliale vertakkingen is.
Met behulp van ImageJ wordt een geraamd beeld van een volledige membraan gecreëerd en wordt het mammale epitheliale gebied (MEA) gemeten. De afbeelding wordt geanalyseerd met behulp van de Sholl analyse plugin, en de waarden voor N en k , onder andere waarden die hier niet worden gebruikt, worden teruggestuurd. Mammary epithelial branching density wordt bepaald door N / MEA te berekenen. De mate waarin vertakking in de buitenste gebieden van het klierpithelium doorloopt, is de vertakkingscomplexiteit en is een indicator voor uniforme distale epitheliale groei. Omdat k een maat is van de distale afname in epithElial branching, het is een effectieve maatstaf voor de vertakkingscomplexiteit en een betrouwbare indicator voor de ontwikkeling van de borst.
Dit protocol beschrijft een computer-geassisteerde methode voor het creëren van geraamiseerde beelden van volledige muizen van de membraan en kwantitatieve evaluatie van de vertakkingseigenschappen van de mammier in peripubertal mannelijke en vrouwelijke ratten. Deze methode is relatief snel en vereist geen gebruik van gespecialiseerde microscopie-apparatuur. Ontwikkeling en validatie van deze werkwijze zijn beschreven in Stanko et al. (2015) 3 . Dit rapport beschrijft ook de bereiding van ratmurgheelkunde hele = mounts. Soortgelijke procedures voor volledige monstering van de mammografie zijn beschreven in de Assis et al. (2010) 4 en Plante et al. (2011) 5 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Van de geboorte tot de puberteit is de groei van de borstklier allometrisch. Na de puberteit ontwikkelt de borstkanker door middel van uitgebreide ductale vertakking en verlenging, die doorgaan tot het epitheel van het mammarium de hele vetpoot opneemt. Vertakkingseigenschappen zijn een belangrijk aspect van de ontwikkeling van de borstklier, en het vermogen om deze kenmerken objectief te kwantificeren kan zeer nuttig zijn voor het beoordelen van de normale ontwikkeling van de borst en voor het identificeren van abnorma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) erkennen voor zijn assistentie bij de validatie van deze methode en voor zijn voortdurende dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canada). Hulp bij de Sholl-applicatie.
Materials
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
References
- Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
- Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
- Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012)
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
- Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
- Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
- Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
- Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
- Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
- Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).
