Sıçan Memesi Bezinde Dallanma Yoğunluğunun Nicelleştirilmesi Sholl Analiz Yöntemini Kullanarak Bütünüyle Tutturulur
Summary
Kemirgen içindeki meme bezi gelişimi tipik olarak tanımlayıcı değerlendirmeler kullanılarak veya temel fiziksel özellikleri ölçerek değerlendirilmiştir. Dallanma yoğunluğu, meme gelişiminin objektif olarak ölçülmesi güç bir göstergesidir. Bu protokol, meme bezi dallanma özelliklerinin niceliksel değerlendirmesi için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır.
Abstract
Artan sayıdaki çalışmalar kemirgen meme bezini bir kimyasal maruziyetin gelişimsel toksisitesini değerlendirmek için bir son nokta olarak kullanmaktadır. Bu maruziyetlerin meme bezi gelişimine olan etkileri tipik olarak ya basit boyutlu ölçümler kullanılarak ya da morfolojik özellikleri puanlayarak değerlendirilir. Bununla birlikte, gelişimsel değişiklikleri yorumlama yöntemleri geniş kapsamlı laboratuarlarda tutarsız çevirilere yol açabilir. Yaygın bir değerlendirme yöntemi gereklidir; böylece, verilerin araştırmalar arasında karşılaştırılmasından uygun yorumlamalar oluşturulabilir. Bu çalışmada meme bezi dallanma özelliklerini belirlemek için Sholl analizi yöntemi uygulanmıştır. Sholl yöntemi başlangıçta nöronal dendritik kalıpların nicelleştirilmesinde kullanılmak üzere geliştirildi. ImageJ, bir açık kaynak görüntü analiz yazılım paketi ve bu analiz için geliştirilmiş bir eklenti kullanarak, meme bezi dallanma yoğunluğu ve ameliyatın karmaşıklığıPeripubertal dişi bir sıçandan meme bezi tespit edildi. Burada açıklanan yöntemler Sholl analizinin, meme bezi gelişiminin önemli bir özelliğinin nicelenmesinde etkili bir araç olarak kullanılmasını sağlayacaktır.
Introduction
Meme bezi dallanma, bez gelişiminin bir göstergesi olarak yaygın olarak değerlendirilen bir özelliktir, ancak objektif olarak nicelik kazanmak zordur. 1953 yılında, Sholl 1 kedi görsel ve motor korteks nöronal dendritik arborization ölçülmesi için bir yöntem tarif edilmiştir ve bu yöntem için bir eklenti Ferriera ve arkadaşları 2 tarafından geliştirilmiştir. Hem nöronlar hem de meme bezleri benzer ağaç benzeri bir yapı sergilediğinden eklenti, peripubertal sıçan meme bezinin 2D görüntülerinde meme epitelyal dallanma yoğunluğunu belirlemek için kullanılmıştır. Peripubertal evre analiz için seçilmiştir, çünkü sütten kesme akademik laboratuvarlarda ve test kılavuz çalışmalarında değerlendirilen bir yaşam evresidir. Sholl analizi, ek eklentileri içeren, açık kaynak görüntü işleme paketi ImageJP olan FIJI ile dağıtılan bir eklentidir. Eklenti, bir predefin çevresini saran konsantrik halkalar dizisi oluşturur(Tipik olarak bir nöronun soma ya da bir meme bezinin birincil kanalının kaynağı) ve nesnenin en uzaktaki kısmına (çevreleyen yarıçap) uzanan bir bölgedir. Ardından halkaların her birinde oluşan kesişme sayısını (N) sayar. Eklenti ayrıca, epitel dallanmasının bozulma hızının bir ölçüsü olan bir Sholl geri dönüşüm katsayısı ( k ) döndürür.
ImageJ kullanılarak, bir meme bezinin tümüyle monte edildiği bir iskelet görüntüsü oluşturulur ve meme epitelyal alanı (MEA) ölçülür. Görüntü, Sholl analizi eklentisi kullanılarak analiz edilir ve burada kullanılmayan diğer değerler arasında N ve k için değerler iade edilir. Göğüs epitelyal dallanma yoğunluğu N / MEA hesaplanarak belirlenir. Dallanma, glandüler epitelin dış bölgelerinde ne kadar devam ettiği dallanma karmaşıklığına eşittir ve üniform distal epitel büyümesinin bir göstergesidir. K , epiteki distal azalmanın bir ölçütüdürDallanma karmaşıklığının etkili bir ölçümüdür ve meme gelişiminin güvenilir bir göstergesidir.
Bu protokol, peripubertal erkek ve dişi sıçanlarda, meme bezi tüm montajlarının iskelet görüntülerini oluşturmak ve meme dallanma özelliklerini kantitatif olarak değerlendirmek için bilgisayar destekli bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem nispeten hızlıdır ve özel mikroskopi ekipmanı kullanılmasını gerektirmez. Bu yöntemin geliştirilmesi ve geçerliliği Stanko ve ark. (2015) 3 . Bu rapor aynı zamanda sıçan meme bezi bütününün hazırlanışını anlatıyor = bağlar. Benzer meme tüm montaj prosedürleri, Assis ve ark. (2010) 4 ve Plante ve ark. (2011) 5 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Doğumdan puberteye kadar, meme bezi büyümesi allometriktir. Ergenlikten sonra meme bezi, geniş yalın dallanma ve uzama yoluyla gelişir ve meme epiteli tüm yağ yastığını kapayana kadar devam eder. Dallanma özellikleri, meme bezi gelişiminin önemli bir yönüdür ve bu özellikleri objektif olarak ölçebilme özelliği, normal meme gelişimini değerlendirmede ve meme zehirlenmelerine erken yaşlanma maruziyetlerini takiben anormal gelişimin belirlenmesinde son derece yararlı olabilir.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu yöntemin geçerliliğine katkıda bulunmak için Dr. Michael Easterling'i (Sosyal ve Bilimsel Sistemler, Inc., Durham, NC) ve Dr. Tiago Ferreira'nın (McGill Üniversitesi, Montreal, Quebec, Kanada) daimi olarak çalışmasını onaylamak ister. Sholl uygulamasıyla ilgili yardım.
Materials
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
References
- Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
- Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
- Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012)
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
- Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
- Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
- Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
- Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
- Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
- Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).
