ショール分析法を用いたラット乳腺全身の分枝密度の定量
Summary
げっ歯類における乳腺発達は、典型的には、記述的評価または基本的物理的属性の測定によって評価されている。分枝密度は、客観的に定量することが困難な哺乳類の発達の指標である。このプロトコールは、乳腺分枝特性の定量的評価のための信頼できる方法を記載している。
Abstract
げっ歯類の乳腺を化学暴露の発生毒性を評価するためのエンドポイントとして利用する研究が増えています。これらの曝露が乳腺発達に及ぼす影響は、典型的には、基本的な寸法測定または形態学的特徴の採点によって評価される。しかし、発達の変化を解釈するための幅広い方法は、研究所間で一貫性のない翻訳につながる可能性があります。研究を通して比較されるデータから適切な解釈が形成されるように、一般的な評価方法が必要です。本研究は、乳腺の分岐特性を定量化するSholl分析法の応用を記載している。 Sholl法はもともとニューロンの樹状パターンの定量化に使用するために開発されました。オープンソースの画像解析ソフトウェアパッケージであるImageJと、この解析用に開発されたプラグインを使用することにより、乳腺分枝密度とam周産期の雌ラットの臍帯腺を決定した。ここに記載されている方法は、Sholl分析を乳腺発達の重要な特徴を定量化するための有効なツールとして使用することを可能にする。
Introduction
乳腺分枝は、一般に腺発生の指標として評価される特性であるが、客観的に定量化することは困難である。 1953年にSholl 1は、猫の視覚および運動皮質におけるニューロンの樹状突起形成を測定する方法を記載し、この技術のためのプラグインはFerriera らによって開発された2 。ニューロンと乳腺の両方が類似の樹状構造を示すため、このプラグインを用いて、周辺期ラット乳腺の2D画像における乳房上皮分岐密度を定量化した。周産期は、離乳は生涯の段階であるため、分析のために選択されました。これは、多くの場合、学術機関や試験ガイドラインの研究で評価されています。 Sholl分析は、FIJIと共に配布されているプラグインです。これはオープンソースの画像処理パッケージImageJで、追加のプラグインが含まれています。プラグインはpredefを囲む一連の同心リングを作成します（典型的には、ニューロンの体細胞または乳腺の主ダクトの起源）を対象とし、対象物の最遠位部分（包囲半径）まで伸びる。次に、各リング上に発生する交差点の数（N）を数えます。また、プラグインはSholl回帰係数（ k ）を返します。これは上皮分岐の減衰率の測定値です。
ImageJを使用して、乳腺全身の骨格化画像が作成され、乳房上皮領域（MEA）が測定される。 Sholl分析プラグインを使用して画像が分析され、ここでは利用されない他の値のうちNとkの値が返されます。乳腺上皮分枝密度は、N / MEAを計算することによって決定される。腺上皮の外側領域で分枝が継続する程度は分枝の複雑さであり、均一な遠位上皮成長の指標である。 kはエピソードにおける遠位減少の尺度であるのでこれは分枝の複雑さと乳房発達の信頼できる指標の有効な尺度である。
このプロトコルは、乳腺全身マウントの骨格化画像を作成し、周辺性雄性および雌性ラットにおける乳房分枝特性を定量的に評価するコンピュータ支援法を記載する。この方法は比較的迅速であり、特別な顕微鏡検査装置の使用を必要としない。この方法の開発および検証はStanko et al。 （2015） 3 。この報告書はまた、ラット乳腺全体=マウントの調製を記載している。同様の哺乳類全体マウント手順が、アシス（Assis） らに記載されている。 （2010） 4およびPlante et al。 （2011） 5 。
Protocol
Representative Results
Discussion
出産から思春期まで、乳腺の成長はアロマティックである。思春期後、乳腺は、乳腺上皮が脂肪パッド全体を占有するまで、広範な管分岐および伸長を経て発達する。分枝特性は乳腺発達の重要な側面であり、これらの特性を客観的に定量化する能力は、乳房の正常な発育を評価し、乳房毒性物質への早期曝露後の異常な発達を同定するために非常に有用であり得る。
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Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、この方法とTiago Ferreira博士（McGill University、カナダ、ケベック州モントリオール）の継続的な成功のために、Michael Islingling博士（ノースカロライナ州ダーラム）を認めたいと思っています。 Shollアプリケーションのサポート。
Materials
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
References
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