פרוטאין tRNA Agarose ג'ל מבחני פיגור לניתוח של<em> N</em<sup> 6</sup> -Treonylcarbamoyladenosine TCDA פונקציה
Summary
פרוטוקול מוצג לייצור tRNA (UUU) וניתוח של tRNA (UUU) במורכבות עם TDAA אנזים ידי מבחני ג 'ל agarose פיגור.
Abstract
אנו מדגימים שיטות הביטוי וטיהור של tRNA (UUU) ב Escherichia coli ואת הניתוח על ידי מבחני ג'ל פיגור של הכריכה של tRNA (UUU) כדי TcdA, N 6- threonylcarbamoyladenosine (לא 6 א) דהידראטאז, אשר cyclizes threonylcarbamoyl בצד שרשרת A37 ב לולאה גזע anticodon (ASL) של tRNAs כדי מחזורי לא 6 A (Ct 6 A). תמלול של גנים סינתטיים קידוד tRNA (UUU) הוא המושרה ב coli עם 1 מ"מ isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ואת התאים המכילים tRNA נקצרים 24 שעות שלאחר אינדוקציה. חלק RNA הוא מטוהרים באמצעות שיטת חומצה פנול החילוץ. טהור tRNA מתקבל על ידי כרומטוגרפיה סינון ג'ל כי ביעילות מפריד את מולקולות tRNA בגודל קטן מחומצות גרעין שלם שלם או מקוטעת. כדי לנתח TCDA מחייב tRNA (UUU), TcdA מעורבב עם tRNA (UUU) ומופרדים על ג'ל agarose יליד על 4 מעלות צלזיוס.TRNA חופשי (UUU) נודדת מהר יותר, בעוד TCDA-tRNA (UUU) מתחמי עוברים פיגור ניידות כי ניתן לצפות על מכתים של ג 'ל. אנו מראים כי TcdA הוא אנזים tRNA (UUU) מחייב. זה assay פיגור ג'ל ניתן להשתמש כדי ללמוד מוטציות TCDA ואת ההשפעות של תוספים וחלבונים אחרים על הכריכה.
Introduction
Assay ג'ל פיגור 1 (הידוע גם בשם assay ניטור אלקטרופורטי ניידות, EMSA) היא שיטה אלקטרופורטית שנועדה ללמוד ולאפיין אינטראקציות חומצה חלבון-חלבון. זה מאפשר ניתוח של DNA- חלבון כמו גם אינטראקציות חלבון- RNA ובמיוחד, אינטראקציות בין tRNA ו tRNA מחייב חלבונים, תוך שימוש ברכיבים מטוהרים או תערובות מורכבות של חלבונים ( למשל , lysates התא) או חומצות גרעין ( למשל , tRNA בריכות). יש לנו להחיל מבחני פיגור ג'ל לחקר האינטראקציה בין tRNA מטוהרים (UUU) ו TcdA, N 6- threonylcarbamoyladenosine (לא 6 A) dehydratase, אשר cyclizes את שרשרת הצד threonylcarbamoyl המצורפת A37 ב לולאה גזע ליקוד (ASL) של tRNAs למחזורי t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA ידוע גם בשם CsdL 3 ,F.> 4. הגן tcdA / csdL יוצר אשכול עם csdA ו- csdE גנים 5 , אשר לקודד את desulfurase ציסטאין ואת acceptor גופרית של מערכת cystinase desulfinate cystinase (CSD) מערכת והוא נדרש כדי לשמור על פונקציית TCDA ב vivo 3 .
הרציונל מאחורי מבחני הפיגור ג'ל הוא, בעוד מולקולות חומצות גרעין חופשי נודדות במהירות לחזית של ג'ל acrylamide או agarose מכוח המטען השלילי הגדול שלהם, את הניידות האלקטרופורטית של קומפלקסים חלבונים של חומצות גרעין אותו מופחת באופן דרמטי. צמצום הניידות הוא דמיינו כמו "משמרת" של קומפלקס חומצות גרעין, אשר לפתור כמו להקות נפרדות. טעון חיוביים גדול מורכבים חומצה גרעין מורכבים להראות שינוי גדול יותר או ירידה ניידות על ג'ל.
מאז ניטרול המטען של המתחם היא תופעה אוניברסליתעבור מתחמי חומצה גרעין חלבונים, assay פיגור ג'ל ניתן ליישם מגוון רחב של קומפלקסים סוגי חומצה גרעין. השיטה היא פשוטה, זול, והוא יכול להתבצע במעבדות עם ציוד מינימלי. זה דורש רק כמויות קטנות של חלבונים ו tRNA. זהו יתרון על פני טכניקות ביופיסיקליות חלופיות, שבדרך כלל צורכות כמויות גדולות יותר של מדגם.
Assay פיגור ג'ל כבר בשימוש נרחב לחקר גורמי שעתוק. Assay שימש כדי לנתח קינטיקה מחייב, כוח, וספציפיות של גורמי שעתוק עבור רצפי DNA שונים. זה היה באמת בתחום זה כי EMSA פותחה לראשונה 6 , 7 . ג'ל מבחני פיגור עם RNA 8 , 9 , 10 , 11 ו מולקולות tRNA שימשו גם במחקר ריבוזוםוכדי לנתח, כפי שאנו עושים כאן, האנזימים שמשנים נוקליאוזידים tRNA לאחר תעתיק.
פרמטרים שונים רבים משפיעים על התוצאה של assay פיגור ג'ל כגון טמפרטורה, איכות החלבון מדגם tRNA, ואת כוחו של הכריכה. תכנון וביצוע זהיר של הניסוי הוא קריטי עבור הפרשנות של התוצאות של חומצה גרעין חופשי מינים הקשורים חלבון. כאן, השתמשנו גנים סינתטיים קידוד tRNA (UUU) משובטים לתוך וקטור ביטוי אשר יזם חסר האתר Shine-Dalgarno ריבוזום מחייב, המוביל סינתזה של כמויות גדולות של tRNA 2 . פרוטוקול מפורט זה נועד לספק מדריך ברור לביצוע ניסויי tRNA ג'ל פיגור תוך הימנעות טעויות נפוצות.
Protocol
Representative Results
Discussion
החלבון tRNA agarose ג'ל פיגור assay המתואר כאן ניתן לשנות במספר דרכים. ראשית, אחוז agarose בג'ל ניתן לצמצם על מנת לאפשר הפרדה והדמיה של מתחמי חלבון tRNA גדול באופן משמעותי מאשר אחד ניתח כאן (120 kDa). שנית, אם חלבון המטרה הוא thermolabile, יש לנקוט אמצעי זהירות נוספים כדי להבטיח כי הטמפרטו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MCV הוא חבר של CIB Intramural תוכנית "מולקולרית מכונות לחיים טובים יותר" (MACBET). המחקר המוביל לתוצאות אלו קיבל מימון מהמוסד הספרדי של סאלוד קרלוס השלישי (PI12 / 01667 ל- MCV), ה- Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R ו- SAF2015-72961-EXP ל- MCV ), הממשלה האזורית של מדריד (S2010 / BD-2316 ל MCV), ואת הנציבות האירופית (Framework Program 7 (FP7)) פרויקט ComplexINC (חוזה מס '279039 כדי MCV). למממנים לא היה תפקיד בתכנון המחקר, איסוף הנתונים וניתוחם, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
